淫羊藿苷通過上調(diào)PPARα/γ信號通路改善無高脂飲食SHR單純性脂肪肝

曾凡群，岳 云，李曉彤，李葉麗，楊 華，楊丹莉

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

脂肪肝是脂肪酸入肝過多而脂蛋白合成代謝發(fā)生障礙，脂肪酸氧化不足時脂質(zhì)沉積于肝臟的一種常見病理改變。包括酒精性脂肪肝與非酒精性單純性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)，后者是脂肪肝中肝細胞脂肪變性最輕的一種，可逐步發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體家族(Peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)是由Green和Issemann在1990年首先發(fā)現(xiàn)并報道的，是Ⅱ型核激素受體家族中的一員，是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子。PPARs的3種亞型為PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，它們的組織分布不同，所具備的生物功能也不盡相同，可調(diào)節(jié)肝臟三酰甘油的聚集且調(diào)節(jié)可逆性脂肪變性轉(zhuǎn)化為不可逆性脂肪變性的過程[2]。但能否通過調(diào)控PPARs改善單純性脂肪肝還應(yīng)繼續(xù)深入研究。自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats, SHR)是目前公認(rèn)的篩選抗高血壓藥物的理想動物模型，已廣泛應(yīng)用于原發(fā)性高血壓及其并發(fā)癥的發(fā)病及防治研究。在SHR肝臟病理中可觀察到肝細胞腫大，偶見有肝細胞壞死現(xiàn)象[3]。Xing等[4]研究發(fā)現(xiàn)SHR出現(xiàn)單純性脂肪肝。

淫羊藿又名仙靈脾，系小檗科淫羊藿屬(Epimediuml.)植物，其主要活性成分之一是淫羊藿苷(Icariin, ICA)，具有增強免疫系統(tǒng)、改善心腦血管功能(如高血壓心臟病、阿爾茲海默癥)等作用[5]。ICA對單純性脂肪肝的改善作用鮮有文獻報道。故本研究擬觀察無高脂飲食的條件下，SHR的肝臟病理是否出現(xiàn)單純性脂肪肝；ICA是否具有抗SHR大鼠單純性脂肪肝的作用，以及該作用是否與調(diào)控PPARα/γ的表達有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 ICA(純度≥98 %，批號：FY17420615，購于南京澤朗醫(yī)藥有限公司)；PPARα兔抗大鼠抗體(貨號：15540-1-AP)；PPARγ兔抗大鼠抗體(貨號：16643-1-AP)；GAPDH鼠抗大鼠抗體(貨號：10494-1-AP)，二抗抗鼠(貨號：5A00001-1)；二抗抗兔(貨號：5A00001-2)均購于Proteintech公司；免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL，上海七海生物有限公司)。

1.2 儀器 Supply Mini-Protean3電泳儀；PowerLab多導(dǎo)生物信號采集分析系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)；Olympus光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R離心機(德國Eppendorf公司)；Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；冰凍切片機(美國Thermo公司)；CCD成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.3 實驗動物及分組 13周齡的雄性SHR大鼠28只及正常對照雄性魏-凱二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)7只，所有實驗大鼠均為無特定病原體動物(specific pathogen-free animal, SPF)，體質(zhì)量260～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2012-0001。所有大鼠均于SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，喂養(yǎng)條件：相對恒定室溫(20～24 ℃)和濕度(58%～62%)，所有實驗動物均自由飲水和進食(飼料為Co60輻照實驗鼠維持飼料，購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司出品。生產(chǎn)許可證號：蘇飼證(2014)01008。其中主要成分(每千克飼糧含量)為水分(g)≤100；粗蛋白(g)≥180；粗脂肪(g)≥40；粗纖維(g)≤50；粗灰分(g)≤80；鈣(g):10～18；總磷(g):6～12；鈣:總磷=1.2∶1～1.7∶1；賴氨酸(g)≥8.2；蛋氨酸+胱氨酸(g)≥5.3。不含高脂飲食成分)。將SPF級的7只WKY大鼠做正常對照組，SPF級的28只SHR大鼠隨機均分為4組，具體分組如下：①正常對照組(WKY大鼠)；②模型組(SHR)；③ICA低劑量組(10 mg/kg)；④ICA中劑量組(20 mg/kg)；⑤ICA高劑量組(40 mg/kg)。ICA低、中、高劑量組分別給予ICA混懸液(10、20、40 mg/kg.ig, bid)，模型組SHR大鼠和對照組WKY大鼠均同樣給藥方式(ig)給予等體積ddH2O，至26周齡。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠血壓測量 采用Kent Scientific CODA系統(tǒng)測量14周齡至26周齡時SHR大鼠和WKY大鼠安靜避光狀態(tài)下的血壓值。每兩周測量1次血壓。

1.4.2 HE染色 給藥12周后，禁食12 h，7%水合氯醛(0.35 g/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉成功后，取各組大鼠肝臟組織約3 mm，固定于4%中性甲醛，固定48 h后脫水、包埋、切片后、進行HE染色，Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟病理學(xué)變化。

1.4.3 冰凍切片的制備及脂肪染色 給藥12周后，禁食12 h，7 %水合氯醛(0.35 g/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉成功后，摘取肝臟。切取一塊肝組織，大小約1 cm3，于-20 ℃下行冰凍切片，切片厚度為8 μm，以沾有明膠的玻片粘片。將切片放入70 %酒精固定1 min，蘇丹Ⅲ浸染1～2 min，用70 %酒精稍洗，蘇木素復(fù)染，水洗，藍化，甘油明膠封片，光鏡下觀察肝組織脂滴的變化。

1.4.4 Western blot檢測各組大鼠肝組織PPARα和PPARγ蛋白水平 取各組大鼠冰凍肝臟組織約100 mg，用組織剪剪碎后放入1 mL RIPA 裂解液中，加入10 μL PMSF溶液，于冰上勻漿后靜置30 min，4 ℃離心20 min，轉(zhuǎn)速為12 000 rpm，取其上清液，待測樣品中的總蛋白濃度采用BCA法進行測定。每孔上樣量為30 μg進行電泳。完成電泳過程后采用 Bio-Rad Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)聚偏氟乙烯(PVDF)膜進行轉(zhuǎn)膜操作，5 %蛋白封閉液封閉2 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗結(jié)合:PPARα(1∶1 000)、PPARγ(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)，4 ℃過夜; TBST洗膜10 min×3次，室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h、TBST洗膜5 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Bio-Rad CCD成像系統(tǒng)獲取圖像。

2 結(jié)果

2.1 SHR血壓變化情況 與WKY組相比，SHR組收縮壓(systolic blood pressure, SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)明顯升高(P<0.05)，給予ICA-L、ICA-M、ICA-H后均可降低SHR的SBP(P<0.05)，且以ICA-H降壓效果最為顯著。與ICA-L組相比，ICA-H組降低SBP和DBP的作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

# vs WKY，P<0.05;* vs SHR，P<0.05; ▲ vs ICA-L，P<0.05。圖1 每組大鼠血壓值的變化(數(shù)據(jù)以

2.2 肝臟組織病理變化 WKY組可見肝血竇和肝索排列整齊。SHR組部分肝細胞水腫，胞漿疏松化，個別細胞氣球樣病變，可見細胞核固縮、核碎裂，核溶解性消失，肝血竇狹窄，以中央靜脈周圍細胞最為明顯。ICA中、高劑量組上述病變均有所改善，以ICA高劑量組改善最為顯著(見圖2)。

2.3 肝臟脂肪染色結(jié)果 WKY組與SHR組細胞核呈藍色，WKY組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無明顯的脂肪變性，SHR組肝細胞體積增大、胞漿中存在大小不等染成桔黃色的脂肪滴，大者可充滿整個肝細胞，中央靜脈周圍或肝小葉脂肪變性，即成片組織脂肪變性，以中央靜脈周圍的細胞最為明顯。ICA中、高劑量組細胞核呈藍色，脂滴分布不均，脂滴量少而散在，無明顯的向心性改變、以ICA高劑量組改善最為顯著(見圖3～4)。

圖2 ICA對SHR肝臟病理變化的影響(標(biāo)尺:100 μm, 放大倍數(shù):200倍)

圖3 ICA對SHR肝臟脂肪染色的影響(標(biāo)尺:100 μm, 放大倍數(shù):200倍)

圖4 ICA對SHR肝臟脂肪染色的影響(標(biāo)尺:100 μm, 放大倍數(shù):400倍)

2.4 ICA對SHR肝臟組織中PPARα、PPARγ的影響 Western blot法檢測了SHR肝臟組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WKY組相比，SHR組PPARα、PPARγ表達明顯下調(diào)(P<0.05)；與SHR組相比，ICA中、高劑量組PPARα、PPARγ表達明顯上調(diào)(P<0.05)。以ICA高劑量組改善程度最為明顯(見圖5～6)。

# vs WKY，P<0.05;* vs SHR，P<0.05; ▲ vs ICA-L，P<0.05。 圖5 ICA對SHR肝臟PPARα表達的影響(數(shù)據(jù)以表示, n=4)

# vs WKY，P<0.05; * vs SHR，P<0.05; ▲ vs ICA-L，P<0.05。 圖6 ICA對SHR肝臟PPARγ表達的影響(數(shù)據(jù)以表示,n=4)

3 討論

ICA是淫羊藿系小檗科淫羊藿屬植物的主要活性成分之一，具有增強免疫系統(tǒng)、改善心腦血管功能(如高血壓心臟病、阿爾茲海默癥)等作用，還具有補腎壯陽、抗衰老等功效。但ICA是否通過作用于PPARα、PPARγ改善無高脂飲食SHR脂肪變作用尚不清楚。

單純性脂肪肝是指肝細胞發(fā)生脂肪變性，并無明顯的炎癥、壞死及纖維化的一類疾病，主要病理表現(xiàn)為大泡性脂肪變性并含有散在脂肪球的肝細胞[6]。脂肪肝是當(dāng)代人常見的慢性病理改變之一。單純性脂肪肝與高血壓、高血脂癥、肥胖、2型糖尿病等代謝綜合征密切相關(guān)[7]。SHR的高血壓心血管并發(fā)癥、外周血管阻力變化等都與人類高血壓患者相似，是篩選抗高血壓藥物的理想動物模型[8]。研究結(jié)果顯示，SHR組肝細胞體積增大、胞漿中存在大小不等染成桔黃色的脂肪滴，大者可充滿整個肝細胞，中央靜脈周圍或肝小葉脂肪變性，即成片的肝臟組織脂肪變性，以中央靜脈周圍的細胞最為明顯。這與Xing等[4]研究發(fā)現(xiàn)SHR可引起單純性脂肪肝的發(fā)現(xiàn)一致。說明本研究中SHR單純性脂肪肝模型造模成功。同時，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICA-H組無高脂飲食SHR血壓明顯降低，肝血竇和肝索排列較SHR組整齊，桔黃色的脂肪滴較SHR組明顯減少。表明ICA能改善無高脂飲食SHR肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，改善肝組織脂肪樣病變作用。

PPARs作為一種配體激活型的核受體，包含三個亞型，分別是PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，并且由各自不同的基因編碼[9]。文獻報道噻唑烷二酮類(TZDs)和非TZDs藥物激活PPARs后，能夠改善胰島素抵抗、糾正脂質(zhì)代謝紊亂[10]；PPARα主要在脂代謝能力強的組織中表達，例如肝臟、骨骼肌、棕色脂肪組織，使肝臟氧化脂肪酸能力加強，進一步調(diào)節(jié)人體的能量代謝平衡(如葡萄糖和脂類代謝)[11]。有研究表明，硒元素上調(diào)PPARα的表達改善大鼠NAFL[12]。白藜蘆醇通過調(diào)控PPARα通路改善脂質(zhì)代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而保護NAFL[13]。因此，當(dāng)脂質(zhì)沉積于肝臟誘發(fā)脂肪肝時，PPARα通過調(diào)控編碼肝脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白AⅠ/AⅡ等基因的轉(zhuǎn)錄和活化，從而影響脂肪酸的攝取、結(jié)合及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運過程，對脂肪性肝病起到一種保護作用。PPARγ主要在肝臟、脂肪組織中高表達，而在腎、脾、肺、腦和血管為低水平表達[14]。桑葉黃酮上調(diào)肝組織PPARγ改善2型糖尿病并發(fā)單純性脂肪肝[15]。此外，PPARα/γ的新型配體異苯酮和輔酶Q10具有逆轉(zhuǎn)脂肪肝發(fā)病的

能力[16]。因此，通過調(diào)控PPARα/γ的表達至少可能對脂肪性肝病有保護作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICA能抑制SHR單純性脂肪性肝組織中PPARα、PPARγ蛋白表達的下調(diào)。故ICA具有改善SHR所致單純性脂肪性肝病作用，其作用機制可能與其上調(diào)PPARα/γ的蛋白表達有關(guān)。