環(huán)氧合酶-2、5-脂氧合酶及代謝產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸腺瘤-腺癌發(fā)生發(fā)展的影響

方興國(guó)，李波濤，劉模榮，王 紅，劉華慶，文國(guó)榮

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科, 貴州 遵義 563099； 2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科， 貴州 遵義 563099)

結(jié)腸癌在消化道惡性腫瘤中發(fā)病率僅次于胃癌，位居第二，近年來(lái)其發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，尤其是中青年更為明顯。通過(guò)外科手術(shù)、放療、化療等綜合治療取得了一些進(jìn)步，但總體5年生存率仍低于50%。為此，早期診斷和有效治療成為臨床醫(yī)學(xué)面臨的挑戰(zhàn)。研究證實(shí)超過(guò)90%以上的結(jié)直腸癌是由腺瘤性息肉惡變而來(lái)，從正常的結(jié)腸粘膜→息肉→腺癌的系列演變過(guò)程中有多種腫瘤因子的參與。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)表達(dá)升高及前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)、白三烯B4(LTB4)生成的增多均參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，使用環(huán)氧合酶-2、5-脂氧合酶抑制劑，可使環(huán)氧合酶-2、5-脂氧合酶及相應(yīng)的下游代謝產(chǎn)物減少，起到抑制腫瘤的作用[1-3]。但它們共同在結(jié)腸腺瘤-腺癌演變中的作用了解甚少。本研究擬檢測(cè)人的正常結(jié)腸粘膜、結(jié)腸增生性息肉、結(jié)腸腺瘤及腺癌組織中COX-2mRNA、5-LOX mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，并通過(guò)二甲基肼(DMH)建立大鼠結(jié)腸腺瘤-腺癌模型，觀察COX-2抑制劑塞來(lái)昔布(Celecoxib)、5-LOX抑制劑齊留通(Zileuton)對(duì)結(jié)腸腺瘤、腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，以及相應(yīng)結(jié)腸組織中的COX-2 mRNA、5-LOX mRNA表達(dá)和下游產(chǎn)物PGE2和LTB4濃度的變化，以研究COX-2、5-LOX對(duì)結(jié)腸腺瘤、腺癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年10月至2017年10月在遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科行腸鏡檢查并經(jīng)病理確診的結(jié)腸標(biāo)本(直徑≥1cm)71例：增生性息肉25例，男12例，女13例，平均為(48±3)歲；腺瘤性息肉31例，男16例，女15例，平均為(46±2)歲；結(jié)腸腺癌15例，男7例，女8例，平均為(58±5)歲；正常結(jié)腸黏膜組織15例，男8例，女7例，平均為(50±2)歲。所選病例均平時(shí)身體健康，主要因出現(xiàn)消化道癥狀就診行腸鏡檢查首次確診的患者。SD大鼠(清潔級(jí)，雄性)55只，購(gòu)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(渝)2012-0005)，體重180～220g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 二甲基肼(Sigma公司)；塞來(lái)昔布、齊留通(美侖生物技術(shù)有限公司);小鼠抗人β-actin抗體(Santa Cruz公司);驢抗山羊IgG(H+L)(碧云天生物科技研究所)；GTVisionTMⅢ抗鼠兔(基因科技上海有限公司)；山羊抗人5-LOX多克隆抗體和山羊抗人COX-2多克隆抗體(Santa Cruz公司)；山羊IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司)；RT-qPCR轉(zhuǎn)錄試劑盒及相關(guān)引物(寶生物TaKaRa公司)；PGE2、LTB4檢測(cè)的ELISA試劑盒(碧云天生物科技研究所)。

1.3 標(biāo)本處理

1.3.1 結(jié)腸息肉及結(jié)腸癌 將腸鏡下摘除的息肉、外科手術(shù)切除癌組織塊及活檢的正常結(jié)腸黏膜剪成大小約2 mm×2 mm×3 mm小塊，等滲鹽水反復(fù)沖洗，濾紙吸干表面水分裝入EP管(每個(gè)標(biāo)本分裝成3～5管) 標(biāo)記后放入液氮保存?zhèn)溆?。剩下的組織放入福爾馬林中送病理科確定組織學(xué)類(lèi)型。

1.3.2 大鼠結(jié)腸腫瘤模型的構(gòu)建及標(biāo)本處理 選用SD大鼠55只，以二甲基肼(DMH)建立結(jié)腸腺瘤-腺癌模型。并隨機(jī)分為5組：DMH組15只，干預(yù)組(DMH+Celecoxib組、DMH+Zileuton組、DMH+Celecoxib+Zileuton組，每組10只)，對(duì)照組10只。DMH組單純予DMH(20 mg/kg)腹腔注射1次/周，并予 生理鹽水灌胃，隔日1次；干預(yù)組在予DMH(20 mg/kg)腹腔注射1次/周的基礎(chǔ)上，同時(shí)每組分別給予Celecoxib (50 mg/kg)、Zileuton (50 mg/kg)、Celecoxib (25 mg/kg)+Zileuton (25 mg/kg)聯(lián)合灌胃，隔日1次；對(duì)照組向腹腔內(nèi)注射生理鹽水1次/周，并予生理鹽水灌胃。每天觀察記錄大鼠生長(zhǎng)活動(dòng)情況。至實(shí)驗(yàn)18周開(kāi)始，每2周每組隨機(jī)處死大鼠1只取材觀察結(jié)腸腫瘤生長(zhǎng)情況，于22周全部處死。SD大鼠處死前禁食24h，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，然后將麻醉后的大鼠仰臥固定在大鼠解剖板上，腹壁備皮，常規(guī)消毒、鋪洞巾，于劍突下沿腹壁切開(kāi)約2.5cm縱向切口，并沿腹白線剪開(kāi)腹壁組織，充分暴露腹腔，檢查腹壁、脾臟、肝臟和腹腔淋巴結(jié)有無(wú)病變，檢查有無(wú)腸梗阻及腹水，從小腸和結(jié)腸交界處及肛門(mén)緣剪下完整的結(jié)直腸，并沿結(jié)腸系膜剪開(kāi)大鼠結(jié)直腸，用等滲冰生理鹽水清洗血污，并用濾紙吸干表面水分，并稱(chēng)重(結(jié)腸濕重)，仔細(xì)觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織，如粘膜異常則取異常處3塊，如黏膜無(wú)異常則腸腔遠(yuǎn)端、中段及近端各取3塊；分別液氮速凍后置于-80℃冰箱保存和4%多聚甲醛固定保存。4%中性甲醛固定的標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、石蠟切片、HE染色、封片，病理切片分別由2位病理科醫(yī)生盲法閱片。

1.4 方法

1.4.1 RT-qPCR法檢測(cè)5-LOX、COX-2 mRNA的表達(dá) 用Trizol提取標(biāo)本的總RNA，全波段酶標(biāo)儀定量提取液中的RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將mRNA合成cDNA。相關(guān)引物序列分別為5-LOX(185bp)：上游引物5′AGATGGTAGAGTGCAGCCTGGAG 3′，下游引物，5′GACAATCTTG TTGGCCAGGTTCTTA 3′；β-actin(186bp)：上游引物 5′TGGCACCCAGCACAATGAA 3′，下游引物5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA 3′。 COX-2(119bp)：上游引物5′CCAGCACTTCACGCATCAG 3′，下游引物5′GCTGTCTAGCCAGAGT TTCACC 3′；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性8min， 1Cycle，PCR反應(yīng)95℃ 15 s，60℃ 1min，40 Cycle。以5-LOX/β-actin、COX-2/β-actin比值×100分別表示5-LOX、COX-2 mRNA表達(dá)量。

1.4.2 Western-blot 法測(cè)定5-LOX、COX-2蛋白的表達(dá) 將留取的各組織標(biāo)本放入新EP管，加入RIPA和PMSF.NaF充分裂解、勻漿，靜置1 h，12 000 r/min離心30 min，留取上清液。用BCA蛋白定量法測(cè)定各組織蛋白含量。以40μg蛋白質(zhì)為上樣量，常規(guī)進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉，分別加入山羊抗人5-LOX多克隆抗體(1∶500)，山羊抗人COX-2多克隆抗體(1∶500)，小鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)作為一抗，4℃過(guò)夜，洗膜，加入驢抗山羊IgG(H+L)(均為1∶1 000)和GTVisionTMⅢ抗鼠兔(1∶1 000)作為二抗，洗膜后ECL發(fā)光，X線膠片曝光，顯影定影洗片，掃描Western印跡膠片，測(cè)定各組蛋白電泳帶積分光密度值，以5-LOX/β-actin、COX-2/β-acting比值表示5-LOX、COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)5-LOX、COX-2蛋白的表達(dá) 取出組織塊福爾馬林中固定、石蠟包埋，制作切片。梯度脫水、去過(guò)氧化物酶、修復(fù)抗原、洗滌、封閉，羊抗人5-LOX多克隆抗體(1∶300) 和山羊抗人COX-2多克隆抗體(1∶300)作為一抗，PBS代替一抗作空白對(duì)照，4℃過(guò)夜，用PBS液洗滌3次，每次5 min，擦干水分而后加入山羊IgG—免疫組化試劑盒ABC即用型(1∶1 000)作為二抗，PBS洗滌去除二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染沖洗，風(fēng)干后封片，顯微鏡下觀察，表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞為胞漿和(或)核膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒，在放大400倍顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野，用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)掃描拍照，用IPP軟件測(cè)定各組織標(biāo)本的積分光密度(IOD值)進(jìn)行半定量分析。

1.4.4 ELISA法檢測(cè)各組標(biāo)本中PGE2/LTB4含量 將各組織標(biāo)本剪碎后加入適量的PBS，充分勻漿使其充分裂解(操作在冰上進(jìn)行)，冰上靜置30 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，收集各組標(biāo)本上清液。按照BCA蛋白定量法測(cè)定各組織總蛋白含量。將各組織蛋白定量為終濃度為8.4 μg/μL，體積為25 μL的稀釋液進(jìn)行ELISA測(cè)試(按試劑盒操作說(shuō)明操作), 分別計(jì)算出各組標(biāo)本的PGE2和LTB4含量(μg/L)，每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)平行孔。

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)直腸不同病理標(biāo)本5-LOX、COX-2 mRNA及蛋白表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常結(jié)黏膜組織細(xì)胞中均見(jiàn)到少量的黃色或棕黃色顆粒；在增生性息肉中，見(jiàn)到少量到中等量的黃色或棕黃色顆粒；在腺瘤息肉中，見(jiàn)到中等量到大量的黃色或棕黃色顆粒，在腺癌組織細(xì)胞中，見(jiàn)到大量的黃色或棕黃色顆粒。對(duì)各組標(biāo)本5-LOX、COX-2蛋白積分光密度后統(tǒng)計(jì)表明，正常黏膜組中表達(dá)最低，在腺癌組中表達(dá)最高，與其余各組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1和表2)。

A:正常結(jié)腸黏膜; B:增生性息肉; C:腺瘤; D:腺癌；×400。圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)中5-LOX、COX-2蛋白在各組織中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示：正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸增生性息肉、結(jié)腸腺瘤息肉及結(jié)腸腺癌組織中5-LOX、COX-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，以腺癌組織升高最為明顯，各組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。特別在腺瘤、腺癌組，與正常結(jié)腸黏膜、增生性息肉組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腺癌組5-LOX、COX-2 mRNA表達(dá)明顯高于腺瘤組，兩相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

組別例數(shù)5-LOX mRNACOX-2 mRNA正常1512.72±0.165#23.80±3.96# 增生2557.21±18.22?#128.21±25.95?#腺瘤31235.20±40.07?#296.73±38.39?#腺癌15421.18±67.05? 324.20±45.62?

* ：與正常組比較，P<0.05；#：與腺癌組比較，P<0.05。

Western-blot結(jié)果顯示：正常腸黏膜組中出現(xiàn)無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)，在腺瘤性息肉及腺癌組織表達(dá)明顯增加，以腺癌組織中最為明顯。與其余各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2和表2)。

A:正常組;B:增生組;C:腺瘤組;D:腺癌組。圖2 5-LOX、COX-2蛋白在不同組中的表達(dá)情況

2.2 各組大鼠結(jié)腸腺瘤-腺癌發(fā)生生長(zhǎng)情況，5-LOX、COX-2 mRNA表達(dá)及PGE2、LTB4含量

2.2.1 結(jié)腸腺瘤-腺癌發(fā)生生長(zhǎng)情況 實(shí)驗(yàn)組及干預(yù)組共45只大鼠，第3周DMH+Celecoxib組死亡1只，第4周DMH組死亡2只，出現(xiàn)腹壁潰爛，死亡率5.54%，尸檢未發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸黏膜病變，不計(jì)入有效動(dòng)物。DMH+Celecoxib組、DMH+Zileuton組、DMH+Celecoxib+Zileuton組和DMH組大鼠逐漸出現(xiàn)食欲減退、體重增長(zhǎng)緩慢、活動(dòng)較前減少，且毛發(fā)稀疏、發(fā)黃，光澤差，后期有部分大鼠出現(xiàn)腹瀉。對(duì)照組10只大鼠精神狀態(tài)好，食欲可，活動(dòng)佳，體重增長(zhǎng)良好，毛發(fā)色澤光亮，無(wú)死亡。于18、20、22周分別處死并解剖各組大鼠，除對(duì)照組未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)外，其余各組大鼠結(jié)腸共發(fā)現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)94枚，其中結(jié)腸腺瘤90枚，結(jié)腸腺癌4枚(見(jiàn)表3)。

組別例數(shù)5-LOX免疫組化Western-blotCOX-2免疫組化Western-blot正常158.722±3.655#0.158±0.045#6.100±1.078#0.212±0.065#增生2510.528±2.434?#0.207±0.061#384.927±58.48?#0.343±0.095?#腺瘤316707.865±838.978?#0.409±0.107?#434.481±41.846?#0.527±0.142?#腺癌157603.092±1052.067?0.672±0.154?801.264±163.977?0.626±0.158?

*：與正常組比較，P<0.05；#：與腺癌組比較，P<0.05。

組別例數(shù)發(fā)生腫瘤大鼠數(shù)(只)腺瘤數(shù)(枚)腺癌數(shù)(枚)腫瘤直徑(mm)結(jié)直腸濕重(g)DMH+Celecoxib 951503.52±0.96?4.20±0.52?#DMH+Zileuton 1061713.71±0.98?4.55±0.64?#DMH+Celecoxib+Zileuton 1051603.24±0.85?4.09±0.50?#DMH 13114234.28±1.025.13±0.49#對(duì)照1000003.51±0.49

*：與DMH組相比較，P<0.05；#：與對(duì)照組相比較，P<0.05。

2.2.2 各組大鼠5-LOX、COX-2 mRNA表達(dá) RT- qPCR檢測(cè)的結(jié)果顯示COX-2、5-LOX mRNA在各組中均有表達(dá)，以DMH組最高、對(duì)照組較低。與其余各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05，見(jiàn)表4)。

組別COX-2 mRNA5-LOX mRNADMH+Celecoxib 1.412±0.126?# 2.266±0.041?#DMH+Zileuton 1.995±0.211?#1.551±0.031?#DMH+Celecoxib+Zileuton 1.435±0.052?#1.503±0.080?#DMH 4.330±0.198?3.632±0.130?對(duì)照 1.058±0.07411.013±0.076

*：與對(duì)照組比較P<0.05；#：與DMH組比較P<0.05。

2.2.3 各組大鼠結(jié)腸標(biāo)本中PGE2、LTB4含量比較 ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示各組結(jié)直腸組織中PGE2、 LTB4的含量均高于對(duì)照組(P<0.05)，以DMH組最高(P<0.05，見(jiàn)表5)。

組別PGE2含量(pg/L)LTB4含量(pg/L)DMH+Celecoxib568.72±17.68?#452.59±8.82?#ΔDMH+Zileuton 647.97±15.22?#Δ 387.45±11.59?# DMH+Celecoxib+Zileuton561.48±9.88?#384.30±5.80?# DMH 708.46±18.90? 567.42±10.21? 對(duì)照 362.10±5.48127.18±3.31

*：與對(duì)照組比較P<0.05；#：與DMH組比較P<0.05；Δ：與DMH+Celecoxib+Zileuton組比較P<0.05。

3 討論

花生四烯酸、多不飽和脂肪酸酶代謝是通過(guò)環(huán)氧合酶和脂氧合酶2條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)生具有多種生物活性的脂類(lèi)終產(chǎn)物類(lèi)花生酸類(lèi)物質(zhì)，這些活性物質(zhì)在維持正常機(jī)體心血管系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡、消除炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用[4-5]。研究表明，LOX 有5-LOX，8-LOX，12-LOX，15-LOX四型，其中15-LOX 可使腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，相反8-LOX，12-LOX，15-LOX能促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，具有抗癌作用[6-7]。 COX可分為COX-1、COX-2兩個(gè)亞型。COX-1在生物體內(nèi)恒定表達(dá)，參與維持有機(jī)體正常的生理功能，然而COX-2在正常組織中不表達(dá)或微量表達(dá)，其表達(dá)增加與炎癥及腫瘤有關(guān)[8]。

5-LOX是體內(nèi)催化花生四烯酸生成生物活性物質(zhì)5-HETE和LTB4的關(guān)鍵酶，普遍存在于人的各類(lèi)組織及血液細(xì)胞中，在正常組織中表達(dá)很甚微，主要分布于白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞中。當(dāng)組織發(fā)生病變時(shí)表達(dá)增多，甚至過(guò)度表達(dá)。Tang 等[9]研究認(rèn)為5-LOX與人體的卵巢、腦、心血管、肺、肝、胰腺等組織的許多疾病有關(guān)，其異常表達(dá)往往會(huì)促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多方面研究證實(shí)5-LOX表達(dá)上調(diào)參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Wen等[10]發(fā)現(xiàn)增加低氧的卵巢癌細(xì)胞中的5-LOX的代謝產(chǎn)物5-HETE和白三烯可促使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中5-LOX表達(dá)增加水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期相關(guān)。Wasilewicz等[12]采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)111例不同病理組織學(xué)類(lèi)型的結(jié)腸息肉研究中發(fā)現(xiàn)， 5-LOX表達(dá)與息肉的大小、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、絨毛狀和管狀腺瘤及組織學(xué)位置有關(guān)，認(rèn)為5-LOX過(guò)渡表達(dá)在結(jié)腸癌致病過(guò)程中起著重要作用。Gounaris等[13]5-LOX抑制劑齊留通能抑制患息肉病老鼠腸息肉減少和息肉相關(guān)性炎癥。本研究通過(guò)RT- qPCR、免疫組化染色及Western-blot檢測(cè)5-LOX基因和蛋白在正常結(jié)腸黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉及腺癌組織中表達(dá)情況，其結(jié)果顯示5-LOX從低表達(dá)逐漸升高，在腺瘤性息肉或腺癌組織中出現(xiàn)了過(guò)表達(dá)，以腺癌組織更為明顯。在DMH結(jié)腸腺瘤-腺癌動(dòng)物模型中，齊留通能抑制5-LOX mRNA高表達(dá)及LTB4產(chǎn)生，減少實(shí)驗(yàn)鼠腺瘤及腺癌發(fā)生及生長(zhǎng)，與DMH組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

COX-2催化體內(nèi)的花生四烯酸生轉(zhuǎn)化為前列腺素限速酶，研究證實(shí)COX-2如食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中存在表達(dá)升高或過(guò)度表達(dá)[14-16]。COX-2參與致癌過(guò)程主要跟下游產(chǎn)物PGE2有關(guān)，其機(jī)制主要包括[17]：①增加VEGF, bFGF, 和 PDGF含量促進(jìn)血管生成；②增加bcl-2和Akt活性抑制細(xì)胞凋亡；③增加基質(zhì)金屬蛋白酶促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移；④降低細(xì)胞因子的產(chǎn)生和NK細(xì)胞活性進(jìn)而降低免疫監(jiān)視。使用塞來(lái)昔布作用于體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞BGC-823以時(shí)間和劑量抑制細(xì)胞的增殖和降低COX-2表達(dá)及PGE2的分泌[18]。家族性腺瘤性息肉病患者在結(jié)腸切除后服用非甾體抗炎藥舒林酸和COX-2抑制劑塞來(lái)昔布可減輕息肉病病情[19]。在我們的臨床研究中發(fā)現(xiàn)鴉膽子油乳注射液聯(lián)合5-氟尿嘧啶+四氫葉酸鈣治療中晚期大腸癌病人的血清中COX-2 和 PGE2水平是降低的[20]。本研究結(jié)果顯示：COX-2 mRNA和蛋白在正常結(jié)腸黏膜中呈微表達(dá)或表達(dá)缺失，在增生性息肉、腺瘤息肉及腺癌中從表達(dá)均逐漸升高，在腺瘤組織和腺癌組織中過(guò)度表達(dá)。在DMH結(jié)腸腺瘤-腺癌動(dòng)物模型中，塞來(lái)昔布能明顯抑制COX-2 mRA表達(dá)及PGE2產(chǎn)生，減少實(shí)驗(yàn)鼠腺瘤及腺癌發(fā)生及生長(zhǎng)，與DMH組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

近年來(lái)，5-LOX和COX-2在腫瘤中的相互表達(dá)關(guān)系及其作用引起一些學(xué)者們的關(guān)注。Knab等[21]研究顯示COX-2和5-LOX能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖，且在能體外培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)COX-2和5-LOX在基因和蛋白兩個(gè)層面上表達(dá)均上調(diào)，當(dāng)其受到阻斷時(shí)，細(xì)胞增殖也隨之停止。Ganesh等[22]通過(guò)外培養(yǎng)分別表達(dá)5-LOX和不同水平的COX-2的3種(HCA7, HT-29 & LoVo)結(jié)腸癌細(xì)胞株研究后認(rèn)為在腫瘤致病過(guò)程中， COX-2和5-LOX途徑同時(shí)并存，單用環(huán)氧合酶抑制劑療效仍就不理想或無(wú)效。而在體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，5-LOX/COX雙重抑制劑利克飛龍比同劑量的塞來(lái)昔布更有效的抑制小腸和結(jié)腸腫瘤的形成[22]。從本實(shí)驗(yàn)究結(jié)果中同樣看到，5-LOX和COX-2在人體正常結(jié)腸黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉及腺癌組織中同時(shí)存在表達(dá)，并隨著病理組織損害的加重(正常黏膜→腺瘤→腺癌)，其表達(dá)逐漸上調(diào)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，COX-2、5-LOX及其PEG2、LTB4在正常組織-結(jié)腸腺瘤-腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)逐漸增加，應(yīng)用COX-2/5-LOX抑制劑，可使COX-2/5-LOX mRNA及代謝產(chǎn)物PGE2/LTB4的減少，抑制結(jié)腸細(xì)胞增殖，有抑制結(jié)腸腺瘤-腺癌發(fā)生發(fā)展的趨勢(shì)。有趣的是，在聯(lián)合使用塞來(lái)昔布、齊留通時(shí)，無(wú)論是5-LOX mRNA/COX-2 mRNA表達(dá)、PGE2/LTB4以及結(jié)腸腺瘤-腺癌的發(fā)生生長(zhǎng)情況，與單用塞來(lái)昔布/齊留通組相比較，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但齊留通組中COX-2 mRNA表達(dá)、PGE2含量明顯高于塞來(lái)昔布組及塞來(lái)昔布+齊留通組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣，塞來(lái)昔布組中5-LOX mRNA表達(dá)、LTB4含量明顯高于齊留通及塞來(lái)昔布+齊留通組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示在5-LOX /COX-2代謝途徑之間甚至與其他相關(guān)酶代謝通路之間存在交通及代償機(jī)制。

綜上所述，在致癌因素作用下，COX-2/5-LOX 能通過(guò)上調(diào)mRNA及蛋白表達(dá)，增加結(jié)腸粘膜組織中PGE2/LTB4含量，促進(jìn)結(jié)腸腺瘤-腺癌的發(fā)生生長(zhǎng)及惡變。COX-2或5-LOX抑制劑能部分抑制致癌劑所致的結(jié)腸腺瘤-腺癌的生長(zhǎng)，即使二者聯(lián)合使用也不能增加抑癌作用。提示COX-2/5-LOX代謝途徑在結(jié)腸腺瘤-腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有一定的作用，二者具有協(xié)同性。這為結(jié)腸腺瘤-腺癌臨床診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。