血管內(nèi)皮生長因子受體亞型在卵巢過度刺激大鼠腹膜的表達

袁弘玉，李 權(quán)

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 貴州 遵義 563099)

卵巢過度刺激綜合征(Ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)是指在輔助生殖技術(shù)過程中由于應(yīng)用促排卵藥物使多個卵泡同時發(fā)育引起的嚴重并發(fā)癥，其主要的臨床表現(xiàn)有雙側(cè)卵巢增大、腹腔積液、胸腔積液、血液濃縮肝腎功能障礙、血栓形成甚至危及患者生命等[1-2]。在體外受精胚胎移植(In vitro fertilization，IVF)周期中總發(fā)生率12%～25%，重度占0.5%～5%[3]，都可能給患者帶來嚴重影響。OHSS的發(fā)病機制至今尚未完全清楚，目前研究認為該病是在人絨毛膜促性腺激素刺激下，卵巢釋放過多血管活性物質(zhì)，如腎素-血管緊張素、前列腺素、組胺、細胞因子類、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等引起毛細血管通透性增加所致[4]。進一步研究認為VEGF是導(dǎo)致毛細血管通透性增加的主要因素[5]。目前應(yīng)用抑制VEGF表達的藥物，仍不能完全預(yù)防該病的發(fā)生，VEGF需與其具體的受體亞型結(jié)合方可發(fā)揮作用[6]，其有3種不同基因編碼的VEGF受體亞型：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1；KDR)和VEGFR-3(Flt-4)。但目前對VEGF受體亞型在該病中的研究卻鮮有報道。

本研究通過建立OHSS大鼠模型，檢測模型大鼠腹膜中血管內(nèi)皮生長因子受體亞型基因和蛋白表達，以期為該病腹腔積液形成的病理生理機制研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 20只清潔級雌性Wistar 大鼠，22日齡，體重55.0～65.0g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006。于無特定病原體(Specific pathogen Free,SPF)動物室飼養(yǎng)，自由飲水，通風(fēng)良好，晝夜正常變化，室溫21～24℃，濕度50%～70%。按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組(NC組)和實驗組(OHSS模型組 )。

1.2 主要試劑與儀器 重組人卵泡刺激素(r-hFSH，艾美捷科技有限公司)；人絨毛膜促性腺激素(hCG；麗珠制藥廠);亞甲藍(Methylene blue，MB，江蘇濟川制藥);Trizol(invitrogen公司，Cat. No. 15596026);RIPA裂解液(Proteintech公司，美國);qRT-PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司);VEGFR1一抗(批號：13687-1-AP)、VEGFR2一抗(批號：26415-1-AP)和VEGFR3一抗(批號：20712-1-AP)和內(nèi)參β-Tubulin(批號：10094-1-AP)購于美國Proteintech公司;兔二抗購于天津索羅門生物公司。ECL(Perkin Elmer，NEL100001EA);光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，日本);721分光光度計(UV-4802型，UNICO公司);高速離心機(5424R，Eppendorf公司);PCR擴增儀(BIOER公司，浙江杭州);凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司，美國);電泳儀(DYY-50型，北京六一儀器廠)等。

1.3 造模方法及取材 按照參考文獻造模方法[7]，對照組(n = 10)從第22日齡開始連續(xù)5d皮下注射0.1mL生理鹽水；OHSS組(n = 10)從第22日齡開始連續(xù)4d皮下注射10IU的r-hFSH，第5天皮下注射30 IU人絨毛促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)OHSS。在hCG注射后48h卵巢顯著增大，表面紫褐色，有多個卵泡形成，出現(xiàn)腹水表明模型建立成功。測量大鼠造模前后體重變化、腹膜血管通透性，隨后進行雙側(cè)卵巢切除和分離腹膜，測量卵巢體積，拍照，取雙側(cè)卵巢組織及一部分腹膜組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于卵巢組織HE染色和腹膜免疫組織化學(xué)檢測；另一部分腹膜組織置于液氮儲存待檢。

1.4 檢測項目

1.4.1 觀察腹水形成和測定腹腔液亞甲藍含量 第28日齡兩組大鼠均肌肉注射鹽酸氯胺酮(0.1 mg/kg)麻醉大鼠。并通過尾靜脈注射1%的亞甲藍0.1 mL。注射后充分按摩腹部。30min后，按頸椎脫臼法處死大鼠。正中切開腹腔，觀察有無腹水, 用5 mL生理鹽水沖洗腹腔。將沖洗液收集到試管中，稀釋至10 mL， 加0.1 mol/L氫氧化鈉0.05 mL過濾，并以3 000 rpm的速度在室溫下離心10 min。然后用分光光度計在波長590 nm測定OD值，根據(jù)OD 值繪制標準曲線，算出腹腔沖洗液MB含量。

1.4.2 大鼠造模前后體重測量 電子天平稱重并記錄其重量。

1.4.3 卵巢體積的測定 取下雙側(cè)卵巢用游標卡尺測卵巢各徑線，算出體積并記錄。

1.4.4 卵巢組織形態(tài)觀察 肉眼及HE染色顯微鏡觀察各組大鼠卵泡數(shù)及卵巢組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.5 免疫組織化學(xué)檢測腹膜VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3蛋白水平 兩組腹膜標本流水沖洗， 4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚度4μm)。然后進行脫蠟，水化，PBS清洗3次。組織切片用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性?？乖蠓袩嵝迯?fù)，滴加PBS稀釋10%山羊血清封閉。一抗孵育過夜：分別滴加VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 的一抗(1∶200)。PBS 清洗3次。 二抗孵育，SABC 孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片。顯微鏡觀察，陽性著色呈棕黃色，Image pro plus 6.0軟件進行平均光密度值半定量分析。

1.4.6 qRT-PCR檢測腹膜VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3 mRNA表達水平 用Trizol提取腹膜組織的總RNA。紫外分光光度法測定 RNA 在 260nm 和 280nm 的吸光度，計算 RNA 含量并確定其完整性。Primer Premier 5.0軟件設(shè)計上下游引物(引物設(shè)計和合成由天津瑞吉因生物有限公司完成)，引物序列見表1。取5μg RNA運用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司，Cat No: 9PIM170)及相關(guān)試劑進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μL。取0.5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物運用SYBR? Premix Ex TaqTM (TaKaRa公司)進行實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：SYBR Green Mix (2x) 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4μL，Primer 1 (5 pmol/μL) 1μL，Primer 2 (5 pmol/μL) 1μL， RT產(chǎn)物 0.5 μL, dd H2O 7.1 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃，4 min，(94℃，30 s；50℃，30 s)×40；95℃，15 s；60℃，30 s；95℃，15 s。以β-actin為內(nèi)參，按2-ΔΔCT法計算待測目的基因相對表達量。

表1引物序列

基因名稱上游序列(5′-3′)下游序列(5′-3′)產(chǎn)物(bp)VEGFR1CTGGTAAAGCAACTAAGAGAGGACAGCCGATGGGACCGTT263VEGFR2CTATGTCTGCTCTGCTCAAGGGTTCCCGTCTTTTAGTACA242VEGFR3CAGGCATAGACAAGAAGGCTCTGCGAAGAAGGTGGAG213β - actinCACCCGCGAGTACAACCTTCCCCATACCCACCATCACACC207

1.4.7 Western blot 檢測腹膜VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3蛋白水平 稱取腹膜組織，按照每1g組織加4mL RIPA裂解液，勻漿器研磨組織，以12 000 r/min離心提取蛋白， BCA法測定蛋白濃度，-80℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，VEGFR1特異性抗體按1∶1 000比例稀釋于封閉液中孵育。洗膜后將辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗按1∶10 000的比例稀釋進行孵育，洗膜后用ECL檢測，顯影。同法檢測VEGFR2和VEGFR3。以β-Tubulin為內(nèi)參。用凝膠成像系統(tǒng)拍照，圖片經(jīng)labworks 4.0掃描圖像進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察正常對照組大鼠卵巢形態(tài)正常，表明淡紅；OHSS組大鼠卵巢體積明顯增大，表面紫褐色，充血、腫脹明顯；顯微鏡下正常對照組卵巢可見各個發(fā)育階段的卵泡，間質(zhì)細胞分布均勻，未見增生。OHSS組大鼠卵巢可見部分發(fā)育期卵泡數(shù)增多，見多發(fā)性卵泡囊腫及黃體囊腫，黃素化明顯，間質(zhì)水腫，卵泡呈多囊性擴張(見圖1～2)。

圖1 兩組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)改變(肉眼觀察)

2.2 兩組大鼠體重、卵巢體積、卵泡數(shù)和腹腔液MB含量比較 兩組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組大鼠無腹腔積液形成，OHSS組大鼠形成明顯腹腔積液；OHSS組大鼠卵巢體積、卵泡數(shù)量及腹腔液MB含量明顯高于正常對照組(P<0.05，見表2)。

A:對照組;B:實驗組;×200。圖2 兩組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)改變

組 別28日齡大鼠體重(g)卵巢體積(mm3)卵泡數(shù)腹腔液MB含量(μg/mL)對照107.71±4.7922.10±4.495.00±1.000.05±0.03實驗105.08±3.1483.13±6.92?15.80±2.17?0.31±0.08?

*：與對照組相比，P<0.05。

2.3 兩組腹膜VEGFR1,VEGFR2和VEGFR3免疫組織化學(xué)染色比較 與對照組比較，VEGFR1在實驗組表達呈陽性，VEGFR2在實驗組表達呈強陽性，VEGFR3在實驗組和對照組均有表達(見圖3)。半定量分析顯示實驗組VEGFR1和VEGFR2的平均光密度值與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，VEGFR3的平均光密度值與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。

A：對照組VEGFR1；B:實驗組VEGFR1；C:對照組VEGFR2;D：實驗組VEGFR2；E:對照組VEGFR3；F:實驗組VEGFR3；×100。圖3 免疫組化檢測兩組大鼠腹膜VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的表達

組別VEGFR1VEGFR2VEGFR3對照133.04±16.0669.01±7.24109.20±27.58實驗244.60±28.50?130.20±16.69?141.60±60.85

*：與對照組相比，P<0.05。

2.4 血管內(nèi)皮生長因子受體亞型(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)mRNA表達水平的比較 實驗組大鼠腹膜VEGFR1、VEGFR2 mRNA的相對表達水平較對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，VEGFR3 mRNA的相對表達水平在兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖4)。

NC：對照組 ;OHSS ：實驗組；*：P<0.05,**：P<0.01。圖4 熒光定量檢測PCR VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 mRNA相對表達量

2.5 血管內(nèi)皮生長因子受體亞型(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)蛋白表達水平的比較 實驗組大鼠腹膜VEGFR1和VEGFR2蛋白的相對表達水平較對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，VEGFR3 蛋白的相對表達水平在兩組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，見圖5)。

*：P<0.05，**：P<0.01。圖5 VEGF受體亞型的代表性蛋白免疫印跡(左)和光密度相對定量(右)

3 討論

卵巢過度刺激綜合征具體發(fā)病機制至今尚未完全闡明。該病主要的病理生理改變是毛細血管通透性明顯增加[3]。研究認為血管通透性增加主要與血管內(nèi)皮細胞的完整性破壞，細胞之間緊密連接和粘附連接打開以及血管內(nèi)皮細胞的回縮等有關(guān)[8]。VEGF是調(diào)節(jié)以上因素引起血管通透性增加的主要因子[1,9]，VEGF家族成員包括VEGF(A、B、C、D、E)和胎盤生長因子(PLGF)，卵巢分泌的VEGF主要是VEGF-A[10]，其常作用于腹膜、胸膜等血管床，能迅速增加血管通透性[11]。VEGF-A主要通過結(jié)合 VEGFR1(Flt-1)和 VEGFR2( Flk-1 / KDR)發(fā)揮分子生物學(xué)效應(yīng)， VEGFR1與VEGF-A結(jié)合對血管通透性的調(diào)節(jié)主要起負向作用，而當(dāng)VEGFA與VEGFR2募集TSAd接頭蛋白復(fù)合物結(jié)合，可調(diào)節(jié)VEGFA誘導(dǎo)的酪氨酸激酶Src活化和血管通透性，激活Src也調(diào)節(jié)粘著斑激酶介導(dǎo)的細胞基質(zhì)附著力，有助于增強滲透效應(yīng)[12]。VEGFR3與VEGF-C/D 結(jié)合主要調(diào)節(jié)淋巴管的生成和發(fā)育[13]。

本研究參照課題組前期制模方案成功建立OHSS大鼠模型。腹膜免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示OHSS大鼠腹膜存在VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3蛋白的表達，前兩者平均光密度值在實驗組增加，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明腹膜VEGFR1，VEGFR2可能與OHSS的發(fā)病機制有關(guān)。熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示實驗組大鼠腹膜VEGFR1 mRNA及蛋白的相對表達水平上調(diào)，VEGFR2 mRNA及蛋白的相對表達水平明顯上調(diào)，提示可能卵巢分泌過多VEGF-A與腹膜局部高表達的VEGFR1和VEGFR2結(jié)合進而影響血管通透性。本實驗VEGFR1在實驗組大鼠腹膜高表達，與Shibuya等[14]研究認為VEGFR1有較高的親和力有相似之處。但Koch等研究認為VEGFR1激酶活性很低，其對血管通透性主要起負向調(diào)節(jié)作用[15]。在我們研究中尚未完全體現(xiàn)，還需進一步研究。Gomez等研究認為OHSS卵巢組織高表達VEGF-A主要與其VEGFR2結(jié)合增加血管通透性，并已證實卵巢VEGFR2的存在[16]。Brien等研究認為VEGFR2在OHSS的發(fā)生中起到了關(guān)鍵作用[17]。本研究也證實腹膜組織VEGFR2 mRNA及蛋白的相對表達水平較對照組顯著上調(diào)，與以上結(jié)果相符合。VEGFR2引起血管通透性增加的可能機制為OHSS大鼠卵巢分泌的VEGF-A與腹膜高表達的VEGFR2結(jié)合將引起c-Src通路的激活導(dǎo)致VE-鈣粘蛋白過度磷酸化，進而介導(dǎo)TSAd銜接蛋白依賴性SRC酪氨酸激酶活化，導(dǎo)致受體內(nèi)化，內(nèi)皮細胞間連接的松散和血管通透性增強引起血管內(nèi)液體的外滲[12,18]。故我們推測腹膜VEGFR1，VEGFR2與卵巢過度刺激大鼠血管通透性增加所致腹腔積液形成有關(guān)，VEGFR2可能起主要作用。

本研究的不足在于對VEGFR1血管通透性的負向調(diào)節(jié)作用未能證實，可能其與VEGFR2介導(dǎo)的信號通路存在差異，這將是我們以后研究的方向，若能找到VEGFR1和VEGFR2之間調(diào)節(jié)血管通透性的平衡點，將為OHSS局部靶向治療提供新的思路。