滅草松對(duì)穗狀狐尾藻的毒性研究

吳 遲，孫 田，何明遠(yuǎn)，蔣紅云，張 蘭，張燕寧，毛連綱，朱麗珍，鄭永權(quán)，劉新剛*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.廣西思浦林科技有限公司，南寧 530001）

水生植物在水體凈化、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面起著重要作用，利用水生植物進(jìn)行農(nóng)藥毒性評(píng)價(jià)等相關(guān)工作也日益受到國內(nèi)外研究人員的重視。穗狀狐尾藻屬小二仙草科，狐尾藻屬，是一種多年生雙子葉沉水植物，在我國各地池塘，溝渠中均有生長(zhǎng)，具有改善水體物理環(huán)境，富集鐵、鈷等金屬，凈化水體，維持水體生物多樣性等作用[1-3]。目前，穗狀狐尾藻已被我國和OECD（經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織）作為標(biāo)準(zhǔn)生物用于化學(xué)農(nóng)藥的毒性測(cè)試。滅草松，又名苯達(dá)松，于20世紀(jì)60年代由巴斯夫公司開發(fā)，在1972年上市的農(nóng)藥品種。其主要用于防除水稻、玉米、大豆、花生等田中的闊葉雜草和莎草科雜草，是一種選擇性觸殺型苗后除草劑，通過葉片接觸和根系吸收，傳導(dǎo)到莖葉，阻礙植物進(jìn)行光合作用和水分代謝，使植物因生理機(jī)能失調(diào)而死。自2009年起，滅草松的銷售額保持穩(wěn)步增長(zhǎng)趨勢(shì)，在世界水稻除草劑市場(chǎng)占據(jù)重要地位[4-5]。因此，筆者采用水相染毒的方法，以明確滅草松對(duì)穗狀狐尾藻的毒性效應(yīng)，并為滅草松的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑

96.3%滅草松原藥（bentazone），江蘇瑞邦農(nóng)藥廠有限公司。

1.1.2 供試生物

穗狀狐尾藻，水生藻安生物科技有限公司。試驗(yàn)前在水-沉積物系統(tǒng)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)7 d，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，有根生成，無藻類污染。每天光照16 h，溫度為20±2℃。

1.1.3 儀器設(shè)備

分析天平、半微量天平、便攜式pH計(jì)、便攜式溶解氧測(cè)定儀，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；組培架，北京中科起源科技有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀、InertSustain C18色譜柱，島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

本研究主要根據(jù)OECD準(zhǔn)則（No.239）[6]，采用水相染毒的方法，進(jìn)行滅草松對(duì)穗狀狐尾藻的毒性效應(yīng)研究，并建立分析方法對(duì)滅草松進(jìn)行真實(shí)濃度檢測(cè)。

1.2.1 穗狀狐尾藻毒性試驗(yàn)

按照等比序列設(shè)置了有效劑量為0.300、0.600、1.20、2.40、4.80、9.60 mg/L等6個(gè)試驗(yàn)處理，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。對(duì)照組設(shè)6次重復(fù)，處理組設(shè)4次重復(fù)，每重復(fù)3棵藻。試驗(yàn)期間，每天光照16 h，溫度為20±2℃，隨時(shí)補(bǔ)充水分，溶液變化量保持在10%以內(nèi)。14 d時(shí)，測(cè)量植物主莖，側(cè)枝和根部的長(zhǎng)度，同時(shí)測(cè)量植物地上部分和根部的鮮重。然后，于60℃條件下，將植物烘干至恒重，測(cè)量地上部分和根部的干重。試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算14 d-EC50值。

1.2.2 分析方法建立

1.2.2.1 儀器方法

采用島津LC-20AT高效液相色譜儀對(duì)滅草松進(jìn)行真實(shí)濃度檢測(cè)。儀器條件如下：色譜柱為InertSustain C18（4.6×150 mm，5μm），進(jìn)樣體積為10 μL，柱溫箱為40℃，流動(dòng)相為乙腈∶0.1%磷酸水溶液（V∶V=40∶60），流速為1.000 mL/min，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器SPD-20A，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，保留時(shí)間為7.70 min。

1.2.2.2 前處理方法

水樣直接過0.22μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2.3 水樣檢測(cè)

在試驗(yàn)開始0、7 d更換試驗(yàn)藥液前后和14 d時(shí)，從對(duì)照組和處理組試驗(yàn)溶液中部取樣檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)計(jì)算生物量增長(zhǎng)抑制率和平均生長(zhǎng)率抑制率，計(jì)算公式參照OECD準(zhǔn)則（No.239）[6]，并采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0概率回歸分析[7]計(jì)算滅草松對(duì)穗狀狐尾藻的半效應(yīng)濃度EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅草松真實(shí)濃度檢測(cè)

在試驗(yàn)開始0、7 d更換試驗(yàn)藥液前后和14 d時(shí)采集試驗(yàn)溶液并對(duì)滅草松進(jìn)行真實(shí)濃度檢測(cè)。試驗(yàn)期間，實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的最大偏差為9.17%，在理論濃度的±20%以內(nèi)，實(shí)測(cè)濃度相對(duì)穩(wěn)定，因此采用理論濃度計(jì)算毒性端點(diǎn)值[8-9]。滅草松對(duì)穗狀狐尾藻毒性試驗(yàn)的暴露濃度見表1。

表1 滅草松測(cè)定結(jié)果

2.2 穗狀狐尾藻毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束后，分別以植物地上部分、根部和整株植物的長(zhǎng)度，干重和鮮重作為測(cè)量變量，以平均生長(zhǎng)率和生物量增長(zhǎng)作為響應(yīng)變量，計(jì)算各處理組的抑制率。結(jié)果顯示，抑制率隨滅草松濃度的升高而升高，呈現(xiàn)出顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系。以地上部分作為測(cè)量變量，長(zhǎng)度、鮮重和干重的ErC50值分別為有效濃度1.48、1.59和1.05 mg/L，EyC50值分別為有效濃度0.783、0.638和0.453 mg/L；以根部作為測(cè)量變量，長(zhǎng)度、鮮重和干重的ErC50值分別為有效濃度1.85、1.08和1.22 mg/L，EyC50值分別為有效濃度1.250、0.441和0.435 mg/L；以整株植物作為測(cè)量變量，長(zhǎng)度、鮮重和干重的ErC50值分別為有效濃度1.59、1.45和1.09 mg/L，EyC50值分別為有效濃度0.923、0.570和0.446 mg/L。滅草松對(duì)穗狀狐尾藻的毒性結(jié)果見表2、3。

表2 滅草松對(duì)穗花狐尾藻毒性結(jié)果（ErC50）

表3 滅草松對(duì)穗花狐尾藻毒性結(jié)果表（EyC50）

3 結(jié)果與討論

滅草松，3-異丙基-(1H)-苯并-2,1,3-噻二嗪-4-酮-2,2-二氧化物，分析檢測(cè)主要包括液相色譜法和氣相色譜法。Thomas等[10]采用梯度淋洗將制劑混雜物中的滅草松溶解出來，然后用液相色譜進(jìn)行測(cè)定。黃誠等[11]采用氣相色譜法測(cè)定水中的滅草松含量。筆者采用高效液相色譜法檢測(cè)試驗(yàn)溶液中滅草松的實(shí)際含量，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)為1.000 0，添加回收有效濃度為0.100和50.0 mg/L時(shí)，回收率范圍分別為101%～107%和101%～102%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.10%和0.108%。該方法科學(xué)靈敏，符合水樣中農(nóng)藥含量分析的要求。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中滅草松因?yàn)榫哂蟹佬Ш茫瑲⒉葑V廣等特點(diǎn)而被廣泛上使用[12-13]。歐洲食品安全局（EFSA）數(shù)據(jù)[14]顯示，20℃條件下，pH值為7和9時(shí)，滅草松在水中溶解度分別為7.7 g/L和17 g/L；25℃條件下，pH值為5、7和9時(shí)，水解穩(wěn)定，即滅草松水中溶解度高，且在水中穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明，滅草松對(duì)穗狀狐尾藻的根、莖和整株植物具有明顯的毒性效應(yīng)。因此，在使用過程中應(yīng)合理使用滅草松，避免對(duì)水生植物產(chǎn)生毒性影響。