扇貝貝殼所含生物活性物質對促進脂肪分解的體外作用探討

閻旭一，劉云春

（1.大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000；2.大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

保護海洋資源，充分利用已得到的資源，是有志者的共識和責任。扇貝貝殼是水產廢棄物，扇貝貝殼含有的成分95%以上是碳酸鈣，有機成分不足5%，在日本和其他歐美國家多作為墻壁涂料、土壤改良劑來加以利用。扇貝貝殼和珍珠的形成機制相似。在我國珍珠粉作為美容原料及中藥成分使用廣泛，價格不菲。為提高扇貝貝殼有效利用的附加值，我們對扇貝貝殼成分進行了較為詳細的實驗研究。扇貝貝殼的抽出成分含有數(shù)種生物活性成分已被前期實驗研究所證實〔1〕。我們使用扇貝貝殼所含的生物活性物質對3T3-L1脂肪細胞的影響進行了體外作用評價；使用對脂肪分解有促進作用的異丙腎上腺素，作為扇貝貝殼所含生物活性物質有無促進脂肪分解作用的對比；使用珍珠所含生物活性物質進行同樣的實驗，來明確脂肪分解作用是否為扇貝貝殼所特有。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 扇貝貝殼甲醇抽出成分的提取 取200 g扇貝貝殼粉碎后，裝入透析袋（MD25），在5%的醋酸溶液中進行透析，溶解除去扇貝貝殼中的碳酸鈣；再用脫離子水透析，除去醋酸；除去醋酸的扇貝貝殼成分進行濃縮干燥后，加入70%甲醇溶解離心，取上清液濃縮干燥，得到扇貝貝殼的甲醇溶解成分。實驗時，用70%甲醇溶解成不同濃度的樣品〔2〕。

1.1.23T3-L1脂肪細胞株 JCRB9014（上海研謹生物科技有限公司提供）。

1.1.3 藥品及試劑 DMEM、NaHCO3、 抗生素（ penicillin-streptomycin）、牛胎兒血清（ FCS）、維生素C、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、Oil Red“ O”染色劑、3.7%甲醛、trtonX-100、葡萄糖及牛血清蛋白（BSA）等，以上試劑均為分析純，由上海泛柯生物科技有限公司和海德創(chuàng)業(yè)（北京）生物科技有限公司提供。

1.1.4 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國SHELLAB）、紫外分光光度儀（日本島津）、生物顯微鏡（奧林巴斯）、24孔細胞培養(yǎng)皿、10 cm直徑細胞培養(yǎng)皿。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)液的組成及配制 ①基礎培養(yǎng)液：取DMEM 1.348 g、NaHCO30.37 g、 抗生素溶液200 μL、FCS 5 mL、維生素C 3.5 mg，脫離子水定容至100 mL，溶解后濾過滅菌備用；②無血清培養(yǎng)液：取DMEM 1.348 g、NaHCO30.37 g、 抗 生 素 溶 液200 μL、維生素C 3.5 mg，加脫離子水容積至100 mL，溶解后濾過滅菌備用；③分化誘導培養(yǎng)液：取DMEM 1.348 g、NaHCO30.37 g、 抗生素溶液200 μL、FCS 5 mL、維生素C 3.5 mg、25 mM地塞米松0.25 μL、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤11.1 mg、胰島素1 mg，加脫離子水定容至100 mL，溶解后濾過滅菌備用；④細胞成熟培養(yǎng)液：取DMEM 1.348 g、NaHCO30.37 g、抗生素溶液200 μL、FCS 5 mL、 維生素C 3.5 mg、 胰島素5 mg，加脫離子水定容至100 mL，溶解后濾過滅菌備用。

1.2.2 PBS和KRP緩沖液的組成及配制 ①PBS緩沖液：NaCl 4 g、Na2HPO40.55 g、KCl 0.1 g、KH2PO40.1 g，加脫離子水定容至500 mL，高壓滅菌后備用；②KRP緩沖液：NaCl 0.7 g、KCl 35.8 mg、CaCl214.7 mg、MgSO429.6 mg、Na2HPO422.3 g、NaH2PO4104.3 mg、葡萄糖193 mg、BSA 2 g，維生素C 10 mg，加脫離子水定容至100 mL，溶解后濾過滅菌備用。

1.2.3 3T3-L1脂肪細胞的分化培養(yǎng)〔2〕將3T3-L1脂肪細胞解凍復蘇，置入10 cm直徑細胞培養(yǎng)皿，加入基礎培養(yǎng)液8 mL，放入CO2培養(yǎng)箱（ 37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)，直至細胞對數(shù)生長期；使用24孔細胞培養(yǎng)皿，將呈對數(shù)生長期的3T3-L1脂肪細胞按每孔3.5×104個細胞的數(shù)量注入，每孔添加基礎培養(yǎng)液1.5 mL，放入CO2培養(yǎng)箱（ 37 ℃、5%CO2） 中培養(yǎng)12 h；12 h后，去除上清液，用PBS溶液洗凈培養(yǎng)細胞2次，添加無血清培養(yǎng)液1.5 mL，放入CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)12 h；12 h后，去除上清液，添加分化誘導培養(yǎng)液1.5 mL，放入CO2培養(yǎng)箱（ 37 ℃、5%CO2）分化培養(yǎng)45 h后，除去上清液，用PBS緩沖液2次洗凈培養(yǎng)細胞，添加細胞成熟培養(yǎng)液1.5 mL，3 d交換一次成熟培養(yǎng)液，持續(xù)一周，得到分化成熟的實驗用3T3-L1脂肪細胞。

1.2.4 3T3-L1脂肪細胞釋放出的游離甘油值測定使用上述分化成熟的3T3-L1脂肪細胞，每孔內分別加入KRP緩沖溶液200 μL，再按不同濃度加入扇貝貝殼（ 70%甲醇溶解）抽出液10 μL，（ 6孔一組濃度）。對照組加入70%的甲醇溶液10 μL，放入CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中反應2 h；反應結束后，回收上清液，使用甘油測定試劑盒（購于上海泛柯生物科技有限公司，日本進口）測定3T3-L1脂肪細胞釋放的甘油值（按試劑盒所示方法進行測定）。同樣方法，使用分化成熟的3T3-L1脂肪細胞，加入不同濃度的異丙腎上腺素、珍珠甲醇抽出成分，測定3T3-L1脂肪細胞釋放的甘油值〔3〕。

1.2.5 3T3-L1脂肪細胞的Oil Red“O”染色 ①配制染色液：取Oil Red“ O”染色劑15 mg、丙醇5 mg，加脫離子水5 mL混合，濾紙過濾備用；②配制3.7%甲醛-PBS溶液：取37%甲醛溶液500 μL，加入PBS溶液4.5 mL；③配制0.1%trtonX-100-PBS溶液：取trtonX-1005 μL，加入PBS 5 mL；④細胞染色：使用上述分化培養(yǎng)成熟的3T3-L1脂肪細胞，分別加入KRP溶液200 μL，實驗組加入2.4 mg/mL扇貝貝殼甲醇抽取液10 μL（70%甲醇溶解），對照組加入70%甲醇10 μL，放入CO2培養(yǎng)箱（ 37 ℃、5%CO2） 中反應2 h；反應結束后除去上清液，用PBS緩沖液2次洗凈，分別加入3.7%甲醛-PBS溶液200 μL，室溫下固定細胞5 min；用PBS洗凈細胞，除去甲醛；分別加入0.1%trtonX-100-PBS溶液200 μL，室溫反應5 min；用PBS洗凈細胞，分別加入Oil Red“ O”染色液200 μL，室溫下染色10 min，染色結束后，用脫離子水洗凈細胞，于顯微鏡下觀察實驗脂肪細胞中脂肪的染色情況。

2 結果

實驗數(shù)據采用t檢驗方法進行統(tǒng)計學處理。

2.1 扇貝貝殼生物活性物質促進脂肪分解作用使用分化成熟的3T3-L1細胞，加入扇貝貝殼的抽取成分的實驗結果顯示出脂肪分解增強的作用，測定得出的甘油值與對照組相比有明顯的增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），升高程度呈濃度依存性。在濃度為4.9 mg/mL處，升高程度接近對照組的2倍，見圖1A。在對3T3-L1細胞脂肪細胞脂肪進行Oil Red“O”染色后的結果也顯示加入扇貝貝殼抽出成分的脂肪細胞內被染成紅色的脂肪（甘油三酯）與對照組相比明顯減少，見圖2。

2.2 異丙腎上腺素促進脂肪分解的作用 使用分化成熟的3T3-L1細胞，加入異丙腎上腺素的實驗結果顯示脂肪分解增強的作用，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在濃度為10 nM時，與對照組相比，升高程度接近1.5倍，見圖1B。

2.3 珍珠抽出成分對脂肪分解的結果 與扇貝貝殼內層有著同樣結構機制構成的珍珠抽出成分進行的實驗結果卻沒有顯示出促進脂肪分解的作用，見圖3。

圖1A 扇貝貝殼生物活性成分對脂肪分解的促進作用

圖1B 異丙腎上腺素的促進脂肪分解作用

圖2 3T3-L1脂肪細胞Oil Red“ O”染色

圖3 珍珠抽出成分對脂肪分解的作用

3 討論

傳統(tǒng)認為脂肪組織是一種起著貯存中性脂肪、供應能量、調節(jié)體溫等功能的組織，近年來發(fā)現(xiàn)脂肪組織還是一個代謝活躍、功能復雜的內分泌器官。人體的脂肪細胞能分泌數(shù)十種脂肪因子（adipocytokrilles）及蛋白質因子，對全身各器官、組織（包括脂肪組織本身）有著重要的調節(jié)功能，故脂肪組織被稱為人體內最大的內分泌腺體〔4〕。脂肪組織分為白色脂肪組織和褐色脂肪組織，白色脂肪組織的功能以儲存甘油三酯（脂肪）為主，是構成動物皮下脂肪和內臟脂肪的主要成分。本實驗中使用的3T3-L1脂肪細胞，是一種能分化成白色脂肪細胞的細胞株，我們使用扇貝貝殼的甲醇（70%）抽出成分對3T3-L1脂肪細胞進行的體外實驗結果顯示，扇貝貝殼的抽出成分中含有促進脂肪分解的生物活性成分，其對脂肪分解的活性程度不亞于異丙腎上腺素對脂肪的分解活性。在對實驗脂肪細胞3T3-L1進行的Oil Red“O”染色的結果，也直觀的顯示了扇貝貝殼抽出成分對脂肪細胞內脂肪的促分解作用。

脂肪分解需要激素敏感性甘油三酯脂酶（HSL）的參與，激素敏感性甘油三酯脂酶（HSL）的活化機制與細胞內cAMP的濃度增加、cAMP蛋白激酶的活化有關〔5〕，扇貝貝殼所含生物活性成分的促進脂肪分解的機制是否與激活激素敏感性甘油三酯脂酶（HSL）機制有關尚不清楚，確切的作用機制有待進一步的研究。

另一方面，我們用同樣的評價方法對珍珠的甲醇抽出成分進行了評價，結果顯示，珍珠抽出成分對脂肪細胞未顯示出促進脂肪分解的作用（P＞0.05，圖3）。珍珠的構成是霰石結晶，而扇貝貝殼的構成是方解石結晶，可能由于構成成分有異而顯示不同的作用〔6-8〕。由此推斷，促進脂肪分解的活性成分可能僅存在于扇貝貝殼中。

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