反相高效液相色譜法測(cè)定小兒金翹顆粒中綠原酸的含量

楊麗波，黃 麗，杜 宏，楊永壽

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

小兒金翹顆粒收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》中（ WS3-893（ Z-178）-2004（ Z）），由金銀花、連翹、葛根、大青葉、山豆根、柴胡、甘草七味中藥組成，具疏風(fēng)清熱，解毒利咽，消腫止痛〔1〕，治療急性扁桃體炎的功效〔2〕。綠原酸是金銀花的主要有效成分，有廣譜抗菌，抗病毒，抗腫瘤等多種藥理作用〔3-4〕，現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中只有對(duì)小兒金翹顆粒中葛根素、苦參堿、甘草的鑒別方法，為了更有效地控制該藥品的質(zhì)量，保證其療效，本文采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對(duì)小兒金翹顆粒中綠原酸的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；SK 5200H型超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀有限公司）；AL204-IC型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號(hào)：110753-200413）；小兒金翹顆粒（四川川西制藥股份有限公司，批號(hào)：20100106、20100103、20100704、20110402）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent XBP-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相為乙腈-0.4磷酸溶液（ 12∶88）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm〔5-6〕；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

圖1 高效液相色譜圖

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品5 mg，置10 mL棕色量瓶中加50%（V/V）甲醇溶解，定容，搖勻，即得濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密移取上述溶液0.5 mL于10 mL棕色量瓶中，加50%（V/V）的甲醇定容、搖勻，即得濃度為0.025 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品0.4 g，置具塞三角瓶中，精密加入50%（V/V）甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理50 min，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用50%（V/V）甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 除去處方中的金銀花，按供試品溶液制備方法，制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 提取溶劑濃度的考察 精密稱取本品0.4 g，共7份，置具塞三角瓶中，各組分別加入20、40、50、60、70、80、100%（ V/V）的甲醇溶液20 mL，按“ 2.2.2”項(xiàng)處理，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定其峰面積并計(jì)算綠原酸的含量，結(jié)果表明用50%（V/V）的甲醇提取時(shí)，綠原酸的含量最高。

2.4 提取溶劑用量的考察 精密稱取本品0.4 g，共5份，置具塞三角瓶中，各分別加入50%（V/V）甲醇10、20、30、40、50 mL作為提取劑，按“ 2.2.2”項(xiàng)處理，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定其峰面積并計(jì)算綠原酸的含量，結(jié)果表明加入甲醇20 mL時(shí)樣品溶液中的綠原酸即可提取完全。

2.5 樣品提取時(shí)間的考察 精密稱取樣品0.4 g，共6份，分別加入50%（ V/V）甲醇20 mL，超聲處理10、20、30、40、50、60 min，制備方法同“ 2.2.2”，按“ 2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定其峰面積并計(jì)算綠原酸的含量，結(jié)果表明超聲提取50 min時(shí)樣品溶液中的綠原酸溶解最完全。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密移取“2.2”項(xiàng)配制的濃度為0.025 mg/mL的對(duì)照品溶液2、20 μL， 再分別移取濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液2、5、10 μL進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程Y=1664X+1.806（ r=1.0），結(jié)果表明綠原酸進(jìn)樣量在0.05～5.00 μg/mL之間有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取已配置好的綠原酸對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)重復(fù)測(cè)定5次，記錄峰面積，RSD為0.71%，結(jié)果表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品0.4g，置具塞錐形瓶中，按“ 2.2.2”項(xiàng)處理，按“ 2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算綠原酸的含量，連續(xù)重復(fù)測(cè)定5次，RSD為0.75%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取本品0.4 g，按“2.2.2”項(xiàng)處理，“2.1” 項(xiàng)色譜條件測(cè)定0、2、4、6、8、10、12 h后的峰面積，結(jié)果綠原酸含量的RSD為0.51%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的同一批號(hào)供試品0.3 g，共6份，各加入0.5 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液3 mL，再加入50%（V/V）的甲醇17 mL，按供試品溶液的制備項(xiàng)下處理，并按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，本法回收率好。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.11 樣品含量測(cè)定結(jié)果 精密稱取3個(gè)不同批號(hào)的樣品0.4 g，按“ 2.2.2”項(xiàng)處理，按“ 2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算樣品中綠原酸的含量。結(jié)果批號(hào)為20110402、20100704、20100103的樣品中綠原酸的含量分別為15.99、14.60、14.21 mg/g。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)提取溶劑甲醇的濃度、用量及提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明用20 mL50%（V/V）的甲醇提取50 min時(shí)，樣品溶液中的綠原酸即可提取完全。在3個(gè)不同批號(hào)的樣品中，綠原酸的含量存在一定差異，這可能與生產(chǎn)過(guò)程中原料的來(lái)源不同有關(guān)〔7〕，為了更好地控制藥品的質(zhì)量，保證其療效，建議藥廠建設(shè)原料藥材的GAP基地。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定綠原酸的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，快速，重現(xiàn)性好，可作為小兒金翹顆粒中綠原酸的含量測(cè)定。

〔1〕國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)：新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)（第66冊(cè)）〔S〕.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：46-49.

〔2〕楊學(xué)峰，鄧星梅.小兒金翹顆粒治療急性扁桃體炎療效觀察〔J〕.醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2009，22（ 3）：278.

〔3〕馬烽，朱亞玲，陳明輝.金銀花中綠原酸提取工藝研究進(jìn)展〔J〕.食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，31（ 7）：164-166.

〔4〕林麗美，劉菊研，王燕，等.RP-HPLC法測(cè)定金銀花中綠原酸的含量〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（ 9）：22-23.

〔5〕王永斌，賈忠，王興剛，等.高效液相色譜法測(cè)定護(hù)肝顆粒中綠原酸的含量〔J〕.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜，2011，31（ 2）：164-166.

〔6〕遲芳振，劉婷.高效液相色譜法測(cè)定抗感顆粒中綠原酸的含量〔J〕.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30（ 4）：512-513.

〔7〕胡生俊，徐岳鑫，董賽文，等.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸含量〔J〕.藥物鑒定，2011，20（ 3）：23.