RP-HPLC法測(cè)定桑姜感冒膠囊中綠原酸的含量

李勝囡，韓本序，劉圣旭，肖培云

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

桑姜感冒膠囊是常用的中成藥制劑，由桑葉、菊花、紫蘇、連翹、苦杏仁、干姜等中藥提取加工制成，具有散風(fēng)清熱，祛寒止咳等功效，用于感冒、咳嗽、頭痛、咽喉腫痛〔1〕。綠原酸為桑姜感冒膠囊配方中的桑葉、菊花、連翹三味藥材的主要活性成分之一〔2〕，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并未對(duì)其含量進(jìn)行控制，本文建立了反相高效液相色譜法測(cè)定綠原酸的含量，能有效控制該藥品的質(zhì)量。所建立的方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于桑姜感冒膠囊中綠原酸的含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)Agilent 1200高效液相色譜儀；SK3200LH超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；AL204-IC電子分析天平（ Mettler Toledo）。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753-200413），桑姜感冒膠囊（ 四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)110148、110127、110116）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（ 9∶91）〔3-4〕；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm〔5-8〕；進(jìn)樣量：10 μL，綠原酸與相鄰峰達(dá)到基線分離，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)不低于5000。HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品10 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇適量，溶解，定容，搖勻，即得濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

圖1 桑姜感冒膠囊HPLC色譜圖

2.3 供試品溶液的制備 取膠囊10粒，取出內(nèi)容物，稱重，計(jì)算平均粒重。精密稱取供試品內(nèi)容物約1.0 g，置100 mL圓底燒瓶中，加60%甲醇25 mL，稱重，超聲處理（ 功率：500 W，頻率：40 kHz）40 min，補(bǔ)重，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 陰性對(duì)照液的制備 按處方比例，制備除桑葉、菊花、連翹外的陰性樣品〔9-10〕，按“ 2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，依法測(cè)定，結(jié)果表明陰性對(duì)照液無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.5 提取溶劑濃度的考察 精密稱取樣品7份，每份約1.0 g，分別加40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇25 mL，超聲提取40 min，補(bǔ)重，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)樣10 μL，測(cè)定綠原酸的峰面積，并計(jì)算綠原酸的平均含量。得提取溶劑濃度與峰面積的關(guān)系如圖2，故選擇60%的甲醇作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑濃度與峰面積的關(guān)系

2.6 提取時(shí)間考察 精密稱取樣品6份，每份約1.0 g，加60%的甲醇25 mL，分別超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）10、20、30、40、50、60 min，按“ 2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定綠原酸的峰面積，并計(jì)算綠原酸的平均含量，結(jié)果表明超聲40 min即可將樣品中的綠原酸提取完全。因此，選擇提取時(shí)間為40 min。 見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間與峰面積的關(guān)系

2.7 線性關(guān)系的考察 精密吸取0.1 mg/mL對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，依次進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=9.0×10-4C-0.2095，r=0.9998， 結(jié)果表明綠原酸進(jìn)樣量在0.02～0.25 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)色譜條件，每次進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積平均值為2349.55，RSD為0.70%（ n=6），表明進(jìn)樣精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（110148）樣品5份，按“ 2.3”項(xiàng)處理，按照“ 2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果供試品中綠原酸的平均含量為1.62 mg/g，RSD為1.60%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，分別在2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL， 測(cè)得綠原酸的RSD為1.30%（n=5），表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取本品（批號(hào)110148，含量1.62 mg/g）10粒的內(nèi)容物，混勻，精密稱取約0.5 g，共6份，按表1精密加入綠原酸對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)步驟操作，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.12 樣品的測(cè)定 取3個(gè)不同批號(hào)的供試品，按“2.3”項(xiàng)步驟操作，并按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算綠原酸的含量，結(jié)果3批樣品中綠原酸的含量分別為1.57、1.57、1.39 mg/g。

3 討論

在流動(dòng)相的選擇過(guò)程中，試驗(yàn)比較了乙腈與水、乙腈與0.2%磷酸、乙腈與0.4%磷酸的多種不同配比，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈：0.4%磷酸（9∶91）出峰時(shí)間適當(dāng)，綠原酸與鄰峰能達(dá)到較好的線分離，峰的對(duì)稱性好，故選擇乙腈0.4%磷酸（9∶91）為該試驗(yàn)的流動(dòng)相。

文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸對(duì)熱不穩(wěn)定，溫度太高綠原酸發(fā)生離解，溫度太低不利于綠原酸的溶出，故選擇50℃作為提取溫度。

曾考察分別用甲醇和乙醇作為提取溶劑，但結(jié)果表明在相同提取時(shí)間內(nèi)甲醇的提取效率更高，這可能與甲醇的分子小，對(duì)植物細(xì)胞的穿透作用強(qiáng)，活性成分的溶出率高有關(guān)，故本試驗(yàn)采用甲醇作為提取溶劑。

采用RP-HPLC法測(cè)定桑姜感冒膠囊中綠原酸的含量，操作簡(jiǎn)便、方法可靠、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，進(jìn)一步提高、完善了原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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