雙向電泳分離水稻葉片蛋白實(shí)驗(yàn)教學(xué)的探索

王琳 陸添宇 楊曉勤 王夢(mèng)芝

[摘 要] 采用雙向電泳法分離水稻葉片蛋白，比較和分析了考馬斯亮藍(lán)染色方法和硝酸銀染色方法對(duì)掃描得到的雙向電泳圖譜的影響。通過(guò)改進(jìn)水稻葉片蛋白的雙向電泳分離方法，可以得到更清晰的雙向電泳圖譜。結(jié)果表明，改進(jìn)后的硝酸銀染色方法靈敏度更高，分離蛋白點(diǎn)更多且清晰。由此可知，改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法可以得到更為靈敏、清晰的雙向電泳圖譜，能更好地適應(yīng)和促進(jìn)雙向電泳分離水稻葉片蛋白的實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。

[關(guān)鍵詞] 實(shí)驗(yàn)教學(xué);改進(jìn);雙向電泳;葉片蛋白;水稻

[基金項(xiàng)目] 2018年度揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)專(zhuān)業(yè)國(guó)際化高水平人才研本一體化培養(yǎng)機(jī)制研究與構(gòu)建（YZUJX2018—1A）

[作者簡(jiǎn)介] 王 琳（1978—），女，江蘇徐州人，博士，揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院講師，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)研究;王夢(mèng)芝（1972—），女，江蘇徐州人，博士，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授（通信作者），主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。

[中圖分類(lèi)號(hào)] G642.0? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ?[文章編號(hào)] 1674-9324（2021）51-0029-04? ? [收稿日期] 2021-05-16

對(duì)于來(lái)自全細(xì)胞、組織或生物體中包含幾千種蛋白質(zhì)的蛋白混合物的分離、檢測(cè)和分析是蛋白質(zhì)組分析的首要目標(biāo)。1975年O’Farrel首先建立了等電聚焦/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF/SDS-PAGE）分離和分析蛋白質(zhì)組分的技術(shù)。這一技術(shù)應(yīng)用兩種不同的分離原理，依據(jù)蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行分離。第一種是依據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷量的不同，用等電點(diǎn)（PI）聚焦技術(shù)分離蛋白質(zhì);第二種是依據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小的差別，通過(guò)蛋白質(zhì)與SDS形成復(fù)合物后，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率的不同達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。雙向電泳技術(shù)，特別是以固相pH梯度等電聚焦為第一向的雙向電泳技術(shù)是當(dāng)前分辨率最高且信息量最大的電泳技術(shù)。利用雙向凝膠電泳可以對(duì)不同樣品或同一細(xì)胞的不同狀態(tài)的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜進(jìn)行對(duì)比和分析。配合分析軟件如PDQuest、Image Master 2D等，找出蛋白質(zhì)表達(dá)量上的差異。同時(shí)，雙向凝膠電泳的分辨率比較高，在應(yīng)用固相pH梯度干膠條和窄pH梯度范圍膠條等技術(shù)后，能夠在一張凝膠上同時(shí)分離出幾千個(gè)甚至上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)[1，2]。雙向電泳具有結(jié)果直觀、分辨率較高、信息量大、技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，因此該實(shí)驗(yàn)成為本科生生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要內(nèi)容。

在雙向電泳中，為了獲得分辨效果好和重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，得到質(zhì)量高的水稻葉片蛋白電泳分離效果，找出合適的染色方法很重要。筆者在使用傳統(tǒng)的雙向電泳分離水稻葉片蛋白實(shí)驗(yàn)[3，4]方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)原來(lái)的染色方法分離的蛋白斑點(diǎn)較少且模糊。為了提高水稻葉片蛋白的雙向電泳分離效果，本文對(duì)此進(jìn)行了探討。

一、實(shí)驗(yàn)材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用水稻秈稻93-11稻種為揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.材料種植與取樣。從5月中旬開(kāi)始分期浸種，每期間隔10天，共7期，浸種時(shí)間為50～60小時(shí)，然后于烘箱中恒溫33℃進(jìn)行催芽2～3天，將已催好芽的種子置于室內(nèi)常溫下，時(shí)間為1天，然后將種子播于已做好的秧板中，約45天后將其移栽入塑料盆缽中，盆深65cm，盆底內(nèi)徑55cm，盆口內(nèi)徑65cm。每個(gè)品種10盆，每盆5穴，于正常條件下生長(zhǎng)。定期施肥，并做好防蟲(chóng)防病和除草工作。在取樣過(guò)程中，葉片保存在冰盒中，然后將葉片于液氮中進(jìn)行固定，固定1天后取出葉片，放置于-80℃的冰箱中保存。

2.儀器。IPGphor電泳系統(tǒng)為Pharmacia公司的產(chǎn)品;Protein II垂直平板電泳槽、循環(huán)水浴箱為Bio-Rad公司的產(chǎn)品;清華紫光掃描儀為清華紫光總公司的產(chǎn)品;PDQUEST 7.2 2-D膠分析軟件為Bio-Rad公司的產(chǎn)品;U-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)為日本HITACHI公司的產(chǎn)品;冷凍干燥離心機(jī)speedvac為Applied Biosystem公司的產(chǎn)品。

3.試劑。固相pH梯度干膠條（pH3-10 L，180mm×3mm×0.5mm ，以及pH3-10 L，235mm×3mm×0.5mm）、載體兩性電解質(zhì)（pH3-10）、IPG緩沖液、過(guò)硫酸銨、PMSF、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250染料等產(chǎn)品購(gòu)自Pharmacia公司;丙烯酰胺、N，N’-亞甲基丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、尿素、甘油、丙基磺酸鹽（CHAPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸等為Amersco公司的產(chǎn)品;二硫蘇糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）、蛋白質(zhì)組級(jí)-胰蛋白酶、鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]、碘乙酰胺（ICH2CONH2）、三氟乙酸（TFA）、碳酸氫銨（NH4HCO3）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）為Sigma公司的產(chǎn)品;四甲基乙二胺（TEMED）為SERVA公司的產(chǎn)品;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為上海伯奧生物制品公司的產(chǎn)品;冰乙酸、甲醇、乙腈（ACN）為國(guó)產(chǎn)分析純和國(guó)產(chǎn)色譜純;雙蒸水由本實(shí)驗(yàn)室提供。

（二）方法

1.水稻葉片蛋白質(zhì)提取。將保存在超低溫冰箱中的葉片取出，取適量放入研缽中，于液氮中研磨至葉片成粉末狀;放入50ml的離心管中，將樣品按1∶3的比例加入溶液A（10%三氯乙酸〔TCA〕和0.07%β-巰基乙醇的預(yù)冷丙酮溶液），充分振蕩，在-20℃下靜置過(guò)夜，然后4℃，11000rpm離心20分鐘，棄去上清，再加入溶液B（含0.07%β-巰基乙醇的冰預(yù)冷丙酮溶液）懸浮沉淀，充分振蕩后，在-20℃下沉淀1小時(shí)，然后4℃，11000rpm離心15分鐘，棄上清，重復(fù)兩次，將最終得到的沉淀物真空冷凍干燥，干燥后的樣品保存在-80℃的冰箱中備用。

2.蛋白質(zhì)含量測(cè)定。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法：Bradford染色液為100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml的95%乙醇，加入100ml、85%（m/v）的磷酸，用水稀釋至1000ml配制而成。試劑的最終濃度為0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7%（m/v）和8.5%（m/v）的磷酸。染色液用濾紙過(guò)濾，保存于室溫棕色瓶中，可使用數(shù)周，每次使用前先過(guò)濾。將BSA配制成濃度1mg/ml的溶液，取8支10ml的試管，1～6號(hào)試管分別加入10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，不足60μl的用水補(bǔ)足至60μl，7號(hào)試管中加入60μl的蒸餾水，8號(hào)試管中加入蛋白質(zhì)樣品溶液6μl，用水補(bǔ)足至60μl，加入3ml的Bradford染色液，充分振蕩混合，2分鐘后于595nm測(cè)定光的吸收值，測(cè)定在1小時(shí)內(nèi)完成。利用不同濃度BSA的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)樣品的光吸收值算出1、2、3蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理。

分別稱取一定量的水稻葉片凍干樣品，溶于裂解液中（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，2%IPG buffer 4-7，1%DTT），樣品超聲波處理5次，每次3～5秒，間隔3秒，于冰水中裂解30分鐘，14000rpm離心20分鐘，取上清，再離心，取上清，以充分去除雜質(zhì)，獲得的蛋白樣品除了少量用作濃度測(cè)定外，其余進(jìn)行分裝，于-80℃保存。每次用之前，將分裝的蛋白樣品取出，在室溫下解凍，根據(jù)所需總的蛋白質(zhì)質(zhì)量取一定體積的蛋白樣品，分別加入相應(yīng)的水化液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%CHAPS，0.4%DTT，0.5%IPG buffer pH4-7或pH3-10），終體積為350μl，再加入微量溴酚藍(lán)振蕩混勻，2000rpm離心1分鐘，將含樣品的水化液均勻地加到水化盤(pán)中。

3.電泳。（1）第一向固相pH梯度等電聚焦。第一向等電聚焦基本是按照雙向電泳手冊(cè)上的方法進(jìn)行。取pH3-10L或pH4-7L，18cm干膠條，去掉保護(hù)膜，準(zhǔn)備水化。把干膠條膠面朝下置于水化盤(pán)中水化，加入IPG覆蓋液使整個(gè)IPG strip被覆蓋。水化時(shí)間為10～12小時(shí)，溫度20℃。取出水化好的膠條，膠面朝上置于持膠槽中，膠條正負(fù)極與持膠槽正負(fù)極要一致，并使膠條與持膠槽兩端電極充分接觸，加適量IPG覆蓋液覆蓋整個(gè)IPG strip。樣品液有兩種加入方式：水化前把樣品液加入水化液中和水化完畢后再在膠條槽加樣杯中加入樣品液，我們一般采用前一種方式。等電聚焦結(jié)束后，取出膠條，加入平衡液A（6mol/L尿素，0.05mol/L Tris-HCI，2%SDS，30%甘油，0.1%DTT，0.002%溴酚藍(lán)）振蕩平衡15分鐘，再換平衡液B（6mol/L尿素，0.5mol/L Tris-HCl，2%SDS，30%甘油，0.4%碘乙酰胺，0.002%溴酚藍(lán)）振蕩平衡15分鐘，取出膠條輕輕潤(rùn)洗，并去除多余的平衡液，準(zhǔn)備第二向電泳。（2）第二向電泳SDS-PAGE。第二向SDS-PAGE基本是按照雙向電泳手冊(cè)上的方法進(jìn)行。采用分離膠濃度為12.5%的連續(xù)SDS-PAGE垂直平板電泳。將已平衡好的第一向膠條置于第二向凝膠的上方，排除氣泡，使二者緊密接觸。用1%的瓊脂糖凝膠封固膠條，接通電源，以15℃循環(huán)水浴冷卻。15mA/塊膠恒流電泳30分鐘，待溴酚藍(lán)前沿移至分離膠中后，再增大電流至30mA/塊膠，待溴酚藍(lán)前沿距凝膠板底0.5～1cm處，終止電泳，剝膠后準(zhǔn)備染色。（3）凝膠染色（常規(guī)考馬斯亮藍(lán)R-250染色）。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在固定液中過(guò)夜，然后在CBB R-250染色液中染色3～4小時(shí)，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，中間更換脫色液2～3次，至背景顏色淺淡，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)清晰即可?；蛘哂谜麴s水漂洗數(shù)次后，用煮沸的蒸餾水脫色至背景顏色淺淡，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)清晰。（4）膠的掃描和保存。掃描儀掃描膠圖后，如果短暫保存，可以將膠放在終止液中，也可將凝膠從終止液中取出，用蒸餾水洗3次，每次5～10分鐘，然后放入密封帶，加1%的乙酸，在4℃下可保存數(shù)月。

（三）實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)

首先采用三氯乙酸—丙酮法提取水稻葉片蛋白，其次用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，最后通過(guò)雙向分離水稻葉片蛋白進(jìn)行第一向等電聚焦后，再進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。具體方法參照文獻(xiàn)[5]等。

電泳結(jié)束后，凝膠改用硝酸銀染色方法染色。將凝膠浸泡于固定液（40%無(wú)水乙醇，10%冰乙酸）中固定30分鐘或過(guò)夜，倒去固定液，換敏化液（30%無(wú)水乙醇，0.2%硫代硫酸鈉，6.8%的乙酸鈉）敏化30分鐘，倒去敏化液，以雙蒸水洗3次，每次5分鐘，然后置于銀染液（0.25%硝酸銀）中染色20分鐘，再次用雙蒸水洗2次，每次1分鐘，接著置于顯色液（2.5%無(wú)水碳酸鈉，0.04%甲醛）中至蛋白質(zhì)斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)為止，倒去顯色液，立即換終止液（1.5%乙二胺四乙酸二鈉）停止顯色，l0分鐘后用雙蒸水洗滌3次，每次5分鐘，此時(shí)凝膠就可以進(jìn)行掃描和分析了。

二、結(jié)果與分析

在雙向電泳中，采用合適的染色方法可以得到令人滿意的雙向電泳圖譜，提高重復(fù)性，并有利于后續(xù)的進(jìn)一步分析。我們?cè)囼?yàn)了2種常用于2-DE中的染色方法以比較其靈敏度。

從圖1可以看出在2種染色方法中，硝酸銀染色法靈敏度最高，可以觀察到許多低峰度蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色法靈敏度最低，大多數(shù)低峰度蛋白質(zhì)斑點(diǎn)無(wú)法顯現(xiàn)。從圖2可以看出相應(yīng)位置的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在采用硝酸銀染色法的膠中最清晰。

三、討論

染色方法對(duì)雙向電泳圖譜的清晰度有很大的影響。好的染色方法可以得到令人滿意的雙向電泳圖譜，提高重復(fù)性，并有利于進(jìn)一步分析。不好的染色方法會(huì)造成圖譜不清晰、蛋白質(zhì)斑點(diǎn)稀少等問(wèn)題[6]。在本實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，改進(jìn)的染色方法更有利于獲得蛋白數(shù)量多、背景清楚、靈敏度高的凝膠圖像，更適合雙向電泳分離水稻葉片蛋白的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

四、結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)方法克服了雙向電泳分離水稻葉片蛋白傳統(tǒng)方法的不足，用硝酸銀染色方法代替原來(lái)的考馬斯亮藍(lán)法，得到了更為靈敏、清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，促進(jìn)了本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作，同時(shí)有利于其他教師從中得到啟發(fā)。

參考文獻(xiàn)

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