高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的柔紅霉素含量

秦建萍

柔紅霉素是治療急性白血病的強(qiáng)效蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素。在柔紅霉素發(fā)酵液中存在大量發(fā)酵雜質(zhì)和一些結(jié)構(gòu)十分相似的蒽環(huán)類化合物，對其進(jìn)行分離和鑒定對柔紅霉素的生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

1 儀器和試藥

Shimadzu高效液相色譜儀及相應(yīng)的化學(xué)工作站;GB-204型電子分析天平;KQ-5200DE數(shù)控型超聲波清洗儀;柔紅霉素對照品;柔紅酮、雙氫柔紅酮、雙氫柔紅霉素、柔紅霉素B、阿霉酮和阿霉素對照品;甲醇為色譜純，草酸、碳酸氫鈉、氯仿、無水硫酸鈉、磷酸二氫銨和冰醋酸為分析純，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil-C18柱;流動相：甲醇-0.01摩爾/升磷酸二氫銨溶液-冰醋酸（62∶38∶0.2），流速：1.0毫升/分鐘;柱溫：30℃;檢測波長：233納米;進(jìn)樣量20微升。

2.2 樣品的處理

對照品溶液的制備：精密稱取柔紅霉素對照品10.12毫克（91.0%），置50毫升容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得202.4微克/毫升的柔紅霉素對照品貯備液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵液的預(yù)處理：取柔紅霉素發(fā)酵液100毫升加入草酸3克，50℃加熱1小時后冷卻離心，吸取上清液4毫升加純化水6毫升和6.6%碳酸氫鈉溶液10毫升，混勻后加入2毫升氯仿，振搖，分取氯仿層加無水硫酸鈉脫水后濃縮至干，加甲醇溶解后進(jìn)行HPLC分析。

2.3 方法學(xué)驗證

線性關(guān)系：分別精密吸取柔紅霉素對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.00毫升于10毫升量瓶中，加甲醇溶解，配制成2.024、4.048、8.096、16.192、20.24微克/毫升的溶液。按上述色譜條件分別進(jìn)樣20微升，以峰面積（A）對對照品質(zhì)量濃度C（微克/毫升）進(jìn)行線性回歸，回歸方程：

A=156.98C+2.911（r=0.9995）。

加樣回收試驗：為驗證方法的可靠性，在已測定含量的發(fā)酵液中加入不同量的柔紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品，由測得結(jié)果計算回收率，結(jié)果見表1，平均回收率為99.93%，RSD為1.89%。

3 結(jié)論

本文以甲醇-0.01摩爾/升磷酸二氫銨溶液（pH4.5）-冰醋酸（62∶38∶0.2）為流動相時柔紅霉素峰形良好，分離度高。筆者采用柔紅霉素發(fā)酵液酸化后萃取法除去干擾雜質(zhì)后測定發(fā)酵液中柔紅霉素含量的高效液相色譜法，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。