姜黃素后處理對缺血再灌注腎損傷大鼠Notch2/Hes-1通路的影響*

（沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，遼寧 沈陽 110024）

肢體缺血再灌注損傷（limb ischemia-reperfusion injury,LIRI）并非局限于肢體，還可以對遠隔臟器造成損傷，特別是血運豐富的腎臟，嚴重的LIRI甚至可以誘發(fā)急性腎功能不全[1-2]。姜黃素（Curcumine,Cur）是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素，是植物姜黃的主要活性成分之一，具有很強的抗炎及抗氧化作用，其對心、腦、腎及腸等臟器損傷有保護作用[3]；研究表明，LIRI是由多種信號通路和因子參與的復雜過程[4]。Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，在進化上高度保守，人和大鼠都具有4種Notch受體[5]。文獻已經(jīng)證明，姜黃素預處理可減輕大鼠腎缺血再灌注損傷[6]，但是有關(guān)姜黃素后處理是否對肢體缺血再灌注腎損傷有保護作用，目前研究甚少。此次實驗性研究旨在進一步探討姜黃素后處理對大鼠肢體缺血再灌注腎損傷時Notch2/Hes-1通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選成年雄性SD大鼠80只（由中國醫(yī)科大學實驗室中心提供），體重280～320 g，6～8月齡，姜黃素（批號：86M1611V，美國Sigma公司），γ-分泌酶抑制劑（DAPT）（美國Santa Cruz公司），堿性磷酸酶標記二抗（美國Santa Cruz公司）。Trizol裂解液（美國Invitrogen公司），Hes-1-mRNA引物[寶生物工程（大連）有限公司]，兔抗大鼠Notch2受體多克隆抗體、兔抗大鼠β-actin多克隆抗體（美國Abeam公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ES-1000 SPM 超聲血流儀（日本 Hayashi Denki公司），DYY-6B型電泳儀（北京六一儀表廠），PCR擴增儀（德國Biometra公司），BX-41型顯微鏡（日本Olympus公司），Scion Image圖像分析系統(tǒng)（美國Apple公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型復制采用隨機數(shù)字表法將80只SD大鼠分為4組（n =20）：假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、姜黃素后處理組（I/R+Cur）、抑制劑組（I/R+DAPT組）。采用參考文獻[7-8]復制大鼠肢體缺血再灌注腎損傷模型。動物飼養(yǎng)于溫度濕度可以調(diào)控的寬敞空間內(nèi)，室溫控制在（23±2）℃，濕度控制于50%～60%，12 h晝/夜交替照明，自由飲水，模型復制前12 h禁食。腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，右頸外靜脈置管建立靜脈通路。于大鼠雙后肢股三角區(qū)切開皮膚，分離股動脈和股靜脈。采用無創(chuàng)微動脈夾于近腹股溝韌帶處夾閉股動脈，使雙后肢缺4 h，隨后松開無創(chuàng)微動脈夾，再灌注4 h。應用ES-1000 SPM超聲血流儀監(jiān)測血流，以未監(jiān)測到血流為缺血標志，監(jiān)測到血流為再灌注成功標準。實驗過程中靜脈輸注生理鹽水 1.5 ml/（kg·h）。Sham組僅分離股動脈和股靜脈，不夾閉；I/R組復制肢體缺血再灌注模型；I/R+Cur組于缺血后4 h即刻腹腔注射姜黃素 200 mg/kg（溶于2 ml生理鹽水中），再灌注4 h；I/R+DAPT 組于缺血后 4 h即刻腹腔注射 DAPT 0.5 μmol（溶于 2 ml生理鹽水），再灌注 4 h ；Sham 組和I/R組以等量生理鹽水替代。

1.3.2 生化指標檢測于再灌注 4 h 時頸動脈取血3 ml，檢測肌酐（Creatinine,Cr）（酶法檢測）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）（二乙酰 - 肟 - 硫氨脲法檢測）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）（紫外分光光度法），隨后放血處死大鼠。

1.3.3 腎組織HE 染色 處死大鼠后迅速開腹，取右腎中部組織置10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，使用BX-41型光學顯微鏡觀察右腎組織病理學改變，同時采用腎小管間質(zhì)半定量評分法對腎炎癥細胞浸潤、腎間質(zhì)水腫、腎小管損傷分別進行半定量分析[8]：炎癥細胞浸潤數(shù)量≤25%為1分，＞25%≤49%為2分，＞49%≤75%為3分，＞75%為4分；腎間質(zhì)水腫輕度為1分，重度為2分；腎小管損傷僅有上皮細胞空泡顆粒變性為1分，伴刷狀緣脫落為2分，伴壞死為3分。腎小管間質(zhì)半定量評分為上述各評分之和。

1.3.4 Westernblotting 檢測腎組織 Notch2 受體蛋白表達 取右腎上極組織 1 cm×1 cm×1 cm，用 4℃生理鹽水沖去殘血，濾紙吸干水分，制備10%組織勻漿，離心提取總蛋白，應用DYY-6B型電泳儀進行蛋白測定。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)模、封閉后，分別加入兔抗大鼠Notch2受體蛋白多克隆抗體、兔抗大鼠β-actin多克隆抗體，4℃孵育過夜；加入堿性磷酸酶標記二抗，室溫孵育2 h，酶法顯色，掃描。采用Scion Image圖像分析系統(tǒng)分析，目的產(chǎn)物與β-actin灰度值的比值反映Notch2受體蛋白表達水平。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測靶分子 Hes-1 mRNA 的表達 取右腎下極 1 cm×1 cm×1 cm 制備10%腎組織勻漿，Trizol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后應用PCR擴增儀進行擴增，引物序列如下：Hes-1 mRNA（163 bp）正向5'-TGGAAATGACAGTGAAGCACCTC-3'，反向 5'-TCG TTCATGCACTCGCTGAAG-3'；β-actin（215 bp）正向5'-TGGCACCCAGCACAATGA-3'，反向 5'-CTAAGTCA TAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。Hes-1 mRNA反應條件：94℃預變性 2 min ；95℃變性 45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，共 35個循環(huán)；72℃延伸 5 min。β-actin反應條件：94℃預變性 2 min ；94℃變性 40 s，58℃退火 40 s，72℃延伸 60 s，30個循環(huán) ；72℃延伸 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，凝膠成像儀成像。采用Scion Image圖像分析系統(tǒng)分析，目的產(chǎn)物與β-actin灰度值的比值反映靶分子Hes-1 mRNA表達水平。

1.3.6 ELISA檢測 TNF-α 和 IL-1β 的表達 于左腎上極和左腎下極各取腎組織 1 cm×1 cm×1 cm，制備10%腎組織勻漿，分別測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1（IL-1β），每組取5孔，將TNF-α標準品按倍比梯度稀釋，然后分別加入檢測孔（100 μl/孔）。收集上清液，依次加入待測孔（100 μl/孔），封板，37℃溫箱避光孵育2 h。洗滌，加入生物素化抗體工作液100 μl/孔，封板，室溫孵育1 h。洗滌。加入HRP工作液100 μl/孔，室溫孵育20 min。洗滌，加入顯色劑100 μl/孔，避光孵育20 min。加入終止液50 μl/孔，輕輕搖勻后置于酶標儀上測 450 nm 處光密度（optical density,OD）值作為測量值。計算與空白孔OD值，并取平均值作為測量值，采用Curve Expert軟件做出標準曲線，并輸入相應的OD值計算TNF-α濃度；同理，檢測IL-1β。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布、方差齊計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組生化指標及腎小管間質(zhì)半定量評分

各組腎小管間質(zhì)半定量評分、Cr、BUN和MDA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Sham組比較，I/R組Cr、BUN和MDA均升高，腎小管間質(zhì)半定量評分增高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Cur組Cr、BUN和MDA降低，腎小管間質(zhì)半定量損傷評分降低（P＜0.05）；與I/R+Cur組比較，I/R+DAPT組各指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

2.2 腎組織HE染色結(jié)果

與Sham組比較，I/R組可見滿視野炎癥細胞浸潤，腎小管周圍有大量顆粒狀物質(zhì)沉積，腎小管擴張明顯，偶可見散在的腎小管管型和萎縮腎小球；與I/R組比較，I/R+Cur組腎間質(zhì)有少量炎癥細胞浸潤，沉積現(xiàn)象減少，但仍可見少量腎小管管型；I/R+DAPT組鏡下所見與I/R+Cur組相同。見圖1。

2.3 腎組織Notch2受體蛋白表達

Notch2受體蛋白在Sham組（0.07±0.02）、I/R組（0.93±0.05）、I/R+Cur組（0.57±0.04）及 I/R+DAPT組（0.61±0.05）中表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（F =4.173，P =0.000）。與 Sham組比較，I/R組Notch2受體蛋白表達升高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Cur組Notch2受體蛋白表達下降（P＜0.05）；與I/R+Cur組比較，I/R+DAPT組Notch2受體蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

表1 各組腎小管間質(zhì)半定量評分、血漿中Cr、BUN和MDA水平的比較（n =20，±s）

表1 各組腎小管間質(zhì)半定量評分、血漿中Cr、BUN和MDA水平的比較（n =20，±s）

注：①與 Sham 組比較，P＜0.05；②與 I/R 組比較，P＜0.05；③與 I/R+Cur組比較，P ＞0.05。

組別 半定量評分 Cr/（μmol/L） BUN/（mmol/L） MDA/（nmol/mg）Sham 組 3±1 63.71±7.13 9.31±1.10 5.11±0.61 I/R組 7±2① 69.01±6.69① 17.42±2.91① 12.01±2.11①I/R+Cur組 4±2② 66.89±5.87② 11.17±1.99② 8.92±2.09②I/R+DAPT組 5±1③ 65.17±7.11③ 12.35±1.76③ 7.98±1.93③F值 3.341 4.901 5.033 6.313 P值 0.000 0.001 0.000 0.013

圖1 各組腎組織光鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE×200）

2.4 靶分子Hes-1 mRNA的表達

圖2 各組腎組織Notch2受體蛋白表達

圖3 各組腎組織Hes-1 mRNA表達

Hes-1 mRNA 在 Sham 組（0.21±0.06）、I/R 組（0.91±0.03）、I/R+Cur組（0.66±0.07）及 I/R+DAPT組（0.69±0.08）中的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（F =3.279，P =0.011）。與Sham組比較，I/R組Hes-1 mRNA表達升高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Cur組 Hes-1 mRNA 表達下降（P＜0.05）；與 I/R+Cur組比較，I/R+DAPT組Hes-1 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖3。

2.5 TNF-α和IL-1β的表達

各組TNF-α和IL-1β表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P 0.05）。與 Sham 組比較，I/R組 TNF-α和IL-1β表達升高（P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+Cur組 TNF-α 和 IL-1β 表達降低（P＜0.05）；與 I/R+Cur組比較，I/R+DAPT組TNF-α和IL-1β表達差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 各組腎組織TNF-α和IL-1β表達水平的比較（n =20，±s）

表2 各組腎組織TNF-α和IL-1β表達水平的比較（n =20，±s）

注：①與Sham組比較，P＜0.05；②與I/R組比較，P＜0.05；③與 I/R+Cur組比較，P ＞0.05。

組別 TNF-α/（mg/ml） IL-1β/（μg/L）Sham 組 1.37±0.51 0.31±0.07 I/R組 3.71±0.65① 1.15±0.12①I/R+Cur組 2.42±0.59② 0.68±0.03②I/R+DAPT組 2.89±0.41③ 0.59±011③F值 4.692 5.327 P值 0.000 0.001

3 討論

有研究證明，姜黃素具有抗氧化應激、抑制炎癥細胞因子釋放、抗細胞凋亡等廣泛的藥理活性[9-10]。其中，姜黃素抗炎和抗氧化作用已引起國內(nèi)外學者的廣泛認同。

目前較為公認，缺血再灌注損傷主要影響因素是氧自由基及其引發(fā)的細胞膜脂質(zhì)過氧化反應[11]。脂質(zhì)過氧化還可以繼發(fā)激活Kupffer細胞，釋放大量氧自由基，被公認為是缺血再灌注損傷早期最主要的損傷因素[12]。生理正常狀態(tài)下，大鼠腎臟組織中自由基的產(chǎn)生和消除速率處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但在肢體發(fā)生缺血再灌注腎損傷時，機體通過兒茶酚胺的自身氧化途徑、中性粒細胞呼吸爆發(fā)、吞噬細胞系統(tǒng)產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基是腎臟缺血再灌注損傷過程中最重要的有害物質(zhì)[13]。大量氧自由基的生成，可激活核因子-κB，使炎癥因子TNF-α和IL-1β等大量釋放。

MDA是機體細胞膜中的不飽和脂肪酸受到氧自由基攻擊后所產(chǎn)生的毒性過氧化物的代謝終產(chǎn)物。由于所產(chǎn)生的過氧化物性質(zhì)極不穩(wěn)定，極難測得其具體含量，但其最終代謝產(chǎn)物MDA的性質(zhì)卻十分穩(wěn)定，所以檢測MDA的含量即可以間接地反應腎臟組織的過氧化程度[14]。

在實驗研究中可見，大鼠肢體缺血再灌注發(fā)生后，鏡下可見腎小管出現(xiàn)小管明顯擴張，管腔內(nèi)可見管型，刷狀緣消失、腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤等病理表現(xiàn)；同時Notch2受體蛋白和靶分子Hes-1 mRNA表達升高；炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β大量釋放。證實Notch2/Hes-1信號通路很可能參與大鼠肢體缺血再灌注所造成的腎臟損傷。TNF-α和IL-1β是啟動炎癥反應的主要細胞因子[15-16]。上述實驗結(jié)果表明，大鼠肢體缺血再灌注激活了腎組織Notch2/Hes-1信號通路，上調(diào)Notch2受體蛋白表達，在相關(guān)酶的作用下產(chǎn)生胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD），NICD繼而進入細胞核與靶分子Hes-1集合形成NICD-Hes-1下游炎癥控制基因激活復合物，促使炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β大量釋放，最后導致腎損傷；但I/R+Cur組鏡下可見腎間質(zhì)內(nèi)炎癥細胞浸潤明顯減少，僅偶可見管腔內(nèi)管型出現(xiàn)；并且Notch2受體蛋白和靶分子Hes-1 mRNA表達均下降；TNF-α和IL-1β釋放遠遠低于I/R組。實驗結(jié)果證實，姜黃素后處理很可能錨定于上游Notch2受體蛋白作為其作用靶點，抑制Notch2受體蛋白的胞內(nèi)端裂解產(chǎn)生胞內(nèi)段NICD，繼而間接地抑制NICD進入細胞核，下調(diào)下游Hes-1 mRNA轉(zhuǎn)錄基因的表達，從而抑制下游炎癥因子TNF-α和IL-1β的釋放，最終實現(xiàn)下調(diào)Notch2/Hes-1信號通路，對腎臟產(chǎn)生保護性作用。

綜上所述，姜黃素后處理可減輕大鼠缺血再灌注腎損傷，其作用機制可能與下調(diào)Notch2/Hes-1信號通路有關(guān)。