中華眼鏡蛇膜毒素12對膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響*

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 泌尿外科，云南 昆明 650101）

膀胱癌是全球第9大常見癌癥，是泌尿系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一[1]。根據(jù)2015年中國國家癌癥登記中心的數(shù)據(jù)，膀胱癌發(fā)病率在男性癌癥中位居第6，在中國的發(fā)病率及病死率呈上升趨勢[2]。在對現(xiàn)有治療手段進(jìn)行規(guī)范和改進(jìn)的同時，探究新的腫瘤治療藥物及靶點成為當(dāng)今學(xué)界的研究熱點。

眼鏡蛇膜毒素12（membrane toxin 12,MT-12）是從中華眼鏡蛇毒粗毒中提取出來的一種堿性膜活性多肽，主要是通過破壞細(xì)胞膜來發(fā)揮其毒性，故稱為膜毒素[3]。根據(jù)毒性生物學(xué)效應(yīng)不同，又可以命名為心臟毒素、細(xì)胞毒素。研究人員發(fā)現(xiàn)蛇毒對多種癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用[4-5]。蛇毒抗腫瘤機制尚未明確，目前研究認(rèn)為其與對腫瘤細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞、干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡等有關(guān)[6]。動物毒液誘發(fā)自噬能力的研究是毒素學(xué)領(lǐng)域的一個新興趨勢，文獻(xiàn)中關(guān)于這一問題的研究較少[7]。故本實驗探究MT-12對膀胱癌細(xì)胞株RT4和T24細(xì)胞增殖、凋亡的影響及與細(xì)胞自噬的關(guān)系，為進(jìn)一步分析動物毒素MT-12與膀胱癌細(xì)胞自噬相關(guān)分子機制的研究提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

膀胱癌細(xì)胞株RT4細(xì)胞、T24細(xì)胞（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗室），MT-12（分子質(zhì)量約為6 700 kD，中國科學(xué)院昆明動物所動物毒素研究室），RPMI 1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（含EDTA）（美國Gibco公司），青霉素、鏈霉素、Western blotting配膠、電泳及轉(zhuǎn)膜液試劑盒、V-ZAD-FMK和氯喹（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CCK-8試劑盒（上海東仁化學(xué)科技公司），Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），甲基噻唑基四唑（MTT）、LC3b一抗（美國 Sigma公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（北京中杉金橋公司），內(nèi)參抗體β-actin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)2株膀胱癌細(xì)胞 RT4 及 T24，于含10% FBS、1% 雙抗的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，5% 二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取處于對數(shù)生長期的膀胱癌細(xì)胞，計數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104個/ml，加入96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個復(fù)孔，200 μl/孔，待細(xì)胞貼壁后丟棄原培養(yǎng)液再加入藥物。實驗組分別加入濃度為 0.10、0.25 和 0.50 μg/ml MT-12 的 RPMI 1640完全培養(yǎng)基 200μl；對照組加入 0.00 μg/ml MT-12的RPMI 1640完全培養(yǎng)基200 ml，無細(xì)胞的空白對照加入 200μl RPMI 1640 完全培養(yǎng)基。加藥后細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別孵育0、24、48、72、96及 120 h，然后加入 CCK-8 10 μl/孔，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱2 h后，用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測各孔的光密度（OD）值。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的膀胱癌細(xì)胞，常規(guī)消化、分離、收集細(xì)胞及細(xì)胞計數(shù)，接種于6孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后加藥處理，實驗組加入 0.50 μg/ml MT-12 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，對照組加入 0.00 μg/ml MT-12的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，同時設(shè)置NC溶媒對照組。消化收集MT-12處理6及24 h的膀胱癌細(xì)胞，離心棄上清液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。用 1×Annexin-binding Buffer液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106個 /ml，每份標(biāo)本體積為 100 μl；5 μl AnnexinV-FITC 和5 μl碘化丙啶染色溶液，室溫下避光反應(yīng) 10 min，加入 400 μl 1×Annexin-binding Buffer，在冰面上輕輕搖勻，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.2.4 細(xì)胞活性檢測取處于對數(shù)生長期的膀胱癌細(xì)胞，計數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104個/ml，細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)貼壁12 h后加藥處理：實驗一組分組為（200 μl MT-12 0.50 μg/ml組、200 μl V-ZAD-FMK 50.00 μmol/L 組、100 μl MT-12 0.50 μg/ml組 +100 μl V-ZAD-FMK 50.00 μmol/L 組），對照組加入 200 μl RPMI 1640 完全培養(yǎng)基；實驗二組（200 μl MT-12 1.00 μg/ml組、100 μl MT-12 1.00 μg/ml+100 μl氯喹5.00 μmol/L 組、100 μl MT-12 1.00 μg/ml+100 μl氯喹 10.00 μmol/L 組），對照加入 200μl RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，設(shè)5個復(fù)孔，設(shè)置空白對照組。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h，離心棄培養(yǎng)液，PBS清洗后，加入10 μl 5 mg/ml的 MTT 溶液培養(yǎng) 4 h，棄原培養(yǎng)基，加入DMSO 100 μl，用酶標(biāo)儀在 490 nm處測定各孔的OD值。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.5 GFP-LC3轉(zhuǎn)染實驗 收集膀胱癌細(xì)胞，以 6×105個/孔接種于6孔板，孵育24 h后用無血清無雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；混合含GFP-LC3質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的培養(yǎng)液，室溫孵育30 min后并緩慢倒入6孔板，培養(yǎng)箱孵育6 h，換含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。將對照組和MT-12（0.50 μg/ml）作用于經(jīng)GFP-LC3轉(zhuǎn)染后的膀胱癌細(xì)胞，且按1×105個/ml種植爬片，待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后用PBS洗滌細(xì)胞2次，4℃丙酮5 min固定后自然干燥。在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光斑點并拍照。

1.2.6 Westernblotting 檢測蛋白表達(dá)情況 收集膀胱癌細(xì)胞，以6×105個/孔接種于6孔板，孵育24 h后，對照組和 MT-12（0.50 μg/ml）處理 24 h，用細(xì)胞裂解液RIPA充分提取蛋白并檢測蛋白濃度，均衡每組蛋白濃度后，以12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，90 V條件下電泳，然后 100 V 4℃電轉(zhuǎn)膜 2 h，5%脫脂奶粉封閉 1 h，TBST 漂洗，加入 LC3b 一抗（1：1 000），4℃過夜，TBST洗3次，再分別加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1：5 000）室溫1 h，TBST洗3次，化學(xué)發(fā)光顯色后膠片成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，多個時間點的比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩個時間點的比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MT-12對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的MT-12處理后0、24、48、72、96和120 h的細(xì)胞OD值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的細(xì)胞OD值有差異（RT4：F =7 208.771，P =0.000 ；T24：F =4 778.191，P =0.000）；②實驗組與對照組的細(xì)胞OD值有差異（RT4：F =264.599，P =0.000；T24：F =243.995，P =0.000），實驗組較對照組細(xì)胞OD值降低，抑制作用增強，細(xì)胞生存率降低。③實驗組與對照組的細(xì)胞OD值變化趨勢有差異（RT4：F =173.869，P =0.000；T24：F =143.520，P =0.000）。不同濃度 MT-12 組處理后細(xì)胞OD值均呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即時間因素和分組因素存在交互作用；不同濃度MT-12組在同一時間48 h前，細(xì)胞OD值無差異（P ＞0.05）；48 h后細(xì)胞 OD 值有差異（P＜0.05）。見圖1和表1、2。

2.2 MT-12對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響

用 0.50 μg/ml MT-12 處理 RT4、T24 細(xì)胞 6 h 后，可觀察到RT4、T24細(xì)胞凋亡的增加（見圖2）。在6及24 h時，對照組與NC溶媒組凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。MT-12組細(xì)胞凋亡率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），24 h凋亡率較6 h大幅度增加（見表3）。MT-12能夠誘導(dǎo)T24細(xì)胞的早期和晚期凋亡，而RT4則是主要發(fā)生早期凋亡（見圖3）。

圖1 不同濃度的MT-12對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 不同濃度MT-12作用不同時間的膀胱癌RT4細(xì)胞增殖情況（±s）

表1 不同濃度MT-12作用不同時間的膀胱癌RT4細(xì)胞增殖情況（±s）

images/BZ_10_237_464_2243_535.pngimages/BZ_10_237_748_2243_819.png0.00 μg/ml 0.20±0.00 0.27±0.06 0.51±0.01 0.72±0.03 1.24±0.05 1.62±0.04 0.10 μg/ml 0.20±0.00 0.26±0.01 0.43±0.03 0.67±0.01 1.11±0.00 1.40±0.04 0.25 μg/ml 0.20±0.00 0.23±0.03 0.30±0.01 0.46±0.04 0.70±0.02 1.12±0.01

表2 不同濃度MT-12作用不同時間的膀胱癌T24細(xì)胞增殖情況（±s）

表2 不同濃度MT-12作用不同時間的膀胱癌T24細(xì)胞增殖情況（±s）

MT-12 濃度 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 0.00 μg/ml 0.20±0.00 0.26±0.01 0.42±0.03 0.60±0.02 0.83±0.02 1.33±0.03 0.10 μg/ml 0.20±0.00 0.26±0.01 0.39±0.01 0.51±0.02 0.72±0.02 1.17±0.06 0.25 μg/ml 0.20±0.00 0.25±0.01 0.28±0.03 0.47±0.03 0.58±0.02 0.90±0.02 0.50 μg/ml 0.20±0.00 0.23±0.01 0.26±0.02 0.32±0.02 0.48±0.02 0.53±0.03

2.3 V-ZAD-FMK和MT-12對膀胱癌細(xì)胞活性的影響

用 0.50 μg/ml MT-12 和 pan-Caspase 抑制劑 VZAD-FMK 50.00 μmol/L處理膀胱癌RT4和T24細(xì)胞后，各組的RT4、T24細(xì)胞活性率分別為：V-ZAD-FMK組（1.07±0.12）%、（1.09±0.12）%；MT-12組（0.59±0.03）%、（0.31±0.05）%；MT-12+V-ZAD-FMK 組（0.71±0.04）%、（0.55±0.06）%；各組RT4、T24細(xì)胞活性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（RT4：F =49.505，P =0.000；T24：F =95.447，P =0.000）。RT4、T24細(xì)胞對照組與V-ZAD-FMK組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t =1.427和 1.696，P =0.179和 0.116）；RT4、T24細(xì)胞對照組與MT-12組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =8.942 和 12.859， 均P =0.000）；RT4、T24 細(xì) 胞MT-12組與MT-12+V-ZAD-FMK組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =2.592和 4.452，P =0.024和 0.001）。見圖4。

圖2 0.50 μg/ml MT-12對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響（±s）

表3 各組RT4、T24細(xì)胞凋亡情況（%，±s）

表3 各組RT4、T24細(xì)胞凋亡情況（%，±s）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

T24凋亡率 RT4凋亡率6 h 24 h 6 h 24 h對照組 0.46±0.23 0.55±0.34 4.89±0.25 5.35±0.12 NC溶媒組 0.22±0.12 0.35±0.12 4.84±0.02 5.86±0.23 MT-12組 9.22±0.31? 30.27±3.50? 20.63±1.54? 27.93±2.41?F值 1 449.344 215.448 306.230 254.634 P值 0.000 0.000 0.000 0.000組別

2.4 MT-12對膀胱癌細(xì)胞自噬的影響

GFP-LC3轉(zhuǎn)染膀胱癌RT4和T24細(xì)胞后表達(dá)綠色熒光蛋白GFP，細(xì)胞無自噬時GFP-LC3廣泛分布在細(xì)胞中。與對照組比較，MT-12處理的膀胱癌RT4和T24細(xì)胞在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為綠色熒光點聚集現(xiàn)象。見圖5。

圖3 MT-12對膀胱癌T24、RT4細(xì)胞凋亡的影響

2.5 MT-12對膀胱癌細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)影響

圖4 MT-12和Z-VAD-FMK對膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響（±s）

在自噬過程中，LC3的胞質(zhì)形式（LC3-Ⅰ）轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺結(jié)合形式（LC3-Ⅱ）。因此，LC3通常被用作監(jiān)測自噬水平的分子標(biāo)記。0.50 μg/ml MT-12處理膀胱癌細(xì)胞RT4和T24后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量分別為：對照組（0.05±0.00）和（0.79±0.04）；實驗組（0.97±0.08）和（0.29±0.03）；實驗組RT4和T24均較對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =18.847和 16.154，均P =0.000）。見圖6。

2.6 氯喹和MT-12對膀胱癌細(xì)胞活性的影響

用1.00 μg/ml MT-12和自噬抑制劑氯喹5.00和10.00 μmol/L處理膀胱癌細(xì)胞，各組的細(xì)胞活性率分別為（0.30±0.02）%、（0.45±0.05）%和（0.62±0.03）%，各組細(xì)胞活性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F =403.501，P =0.000）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，1.00 μg/ml MT-12+ 氯喹5.00 和 10.00 μmol/L 組相對單獨 1.00 μg/ml MT-12處理組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =7.056和15.174，均P =0.000）。見圖7。

圖5 GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膀胱癌RT4和T24細(xì)胞熒光圖及斑點（熒光倒置顯微鏡×400）

圖6 MT-12處理膀胱癌細(xì)胞RT4和T24后LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的表達(dá)（±s）

圖7 氯喹和MT-12對膀胱癌細(xì)胞活性的影響（±s）

3 討論

膀胱癌是泌尿道最常見的惡性腫瘤，預(yù)估2018年，美國將有81 190例新病例和17 240例死亡病例[1]。臨床上，膀胱癌被分類為非肌層浸潤性膀胱癌和肌肉浸潤性膀胱癌。目前，約有75%的病例初診時局限于黏膜或黏膜下層，然而，大約50%～70%非肌層浸潤性膀胱癌的患者有腫瘤復(fù)發(fā)，大約10%～30%的病例進(jìn)展為肌肉浸潤性膀胱癌[8]。故尋找更加有效的膀胱癌治療藥物，并充分了解其治療機制成為臨床治療膀胱癌的熱點。

自然產(chǎn)物是新型抗腫瘤藥物的重要來源，許多物質(zhì)均被證實有藥用價值，對腫瘤的藥物治療有巨大貢獻(xiàn)[5]。動物毒液是蛋白質(zhì)和肽的混合物，主要的毒液成分通常包括神經(jīng)毒素、真菌毒素、心臟毒素、蘇木精及催化酶，毒液成分的藥理活性作為潛在治療劑的來源，一些動物毒素表現(xiàn)出深遠(yuǎn)的抗癌作用，影響癌細(xì)胞增殖、遷移、侵入、凋亡活性及新血管形成[5]。MT是眼鏡蛇毒的主要毒性成分之一，既具有心臟毒性，又具有細(xì)胞毒性，尤其是對腫瘤細(xì)胞有毒性的組分，在蛇毒抗腫瘤作用的研究中占首要地位[9]。MT-12是從蛇毒中分離出的一種膜活性多肽，其毒性是通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)。相對分子質(zhì)量為6 000 ～ 7 000 kD，對熱穩(wěn)定。MT-12 已被證明對多種體外腫瘤有選擇性殺傷作用，對正常細(xì)胞的殺傷作用較小[3]；在體內(nèi)能引起腫瘤體積縮小，延長荷瘤小鼠的存活時間，并抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[4]。MT屬于三指毒素家族，其4對高度保守的二硫鍵使得MT的空間結(jié)構(gòu)呈三指狀[10]。通過阻斷煙堿和毒蕈堿性乙酰膽堿受體的活性，三指折疊毒素干擾與神經(jīng)肌肉接頭運作，為潛在特異性的治療劑提供突破口[11]。

自噬是細(xì)胞體內(nèi)平衡和適應(yīng)環(huán)境改變的基本功能，如饑餓和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的清除和異常細(xì)胞器[12]。自噬對腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有雙刃劍的作用，在不同的條件和實驗體系中存在差異。一方面能夠通過降解細(xì)胞中非必需的蛋白質(zhì)或器官，保持細(xì)胞內(nèi)的代謝，為細(xì)胞提供必要的能量，維持細(xì)胞內(nèi)平衡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對化療和放療的抵抗；另一方面，自噬還能夠與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯或相互作用，直接造成腫瘤細(xì)胞自噬性死亡，抑制癌癥的發(fā)展[13]。

本實驗首先檢測不同濃度的MT-12對兩種惡性程度不同的膀胱癌細(xì)胞RT4和T24的增殖影響。CCK-8 結(jié)果顯示 0.10 μg/ml MT-12 對 2株細(xì)胞的生長增殖影響小，而0.25和0.50 μg/ml MT-12能抑制RT4和T24細(xì)胞的增殖。MT-12能夠抑制膀胱癌RT4、T24細(xì)胞的增殖，且具有時間-劑量依賴性。隨著時間的變化，MT-12能夠促進(jìn)RT4和T24細(xì)胞的凋亡。結(jié)果與增殖實驗的結(jié)果趨勢一致，MT-12作用于T24、RT4細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡水平呈時間依賴性上升。

研究MT-12在抑制膀胱癌細(xì)胞增殖的分子機制時，發(fā)現(xiàn)采用Pan-Caspase抑制劑V-ZAD-FMK對2株膀胱癌細(xì)胞系進(jìn)行處理后，MT-12并未完全失去對膀胱癌的抑制效果，暗示細(xì)胞死亡可能并不完全依賴于Caspase途徑。自噬會大量降解胞內(nèi)細(xì)胞器和大分子，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，有學(xué)者稱其為Ⅱ型程序性死亡[14]，其特征是自噬體的出現(xiàn)，不依賴于Caspase途徑。實驗對可能的自噬性死亡做初步檢測發(fā)現(xiàn)，通過MT-12作用于膀胱癌細(xì)胞株后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大，GFP-LC3轉(zhuǎn)染結(jié)果自噬體（綠色熒光點）增多。檢測結(jié)果表明MT-12能夠引起細(xì)胞的自噬。氯喹被認(rèn)為是自噬抑制劑之一，為進(jìn)一步明確MT-12與自噬關(guān)系，實驗用氯喹和MT-12同時處理膀胱癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯喹能夠消除MT-12對膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制作用。這說明自噬性的死亡可能發(fā)生在MT-12對膀胱癌細(xì)胞的抑制作用過程中。

綜上所述，MT-12對RT4和T24細(xì)胞增殖具有抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及自噬，其中具體分子機制及體外研究尚待進(jìn)一步研究探討。