植物多糖的提取純化、結構鑒定以及生物活性研究進展

馬文英 季一順

[摘要]植物多糖是從植物中提取的天然活性物質(zhì)，大量研究證明其有廣泛的生物活性。文章闡述植物多糖的提取純化、結構解析以及生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂、抗氧化等及其相應的作用機制，并對植物多糖的研究進行展望，以期為植物多糖活性的開發(fā)與利用提供參考。

[關鍵詞]植物多糖;提取純化;結構鑒定;生物活性

中圖分類號：R284.2? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190717

代謝綜合征包括心血管疾病、糖尿病和相關并發(fā)癥等疾病，是所有工業(yè)化國家人口的主要死亡原因[1]。目前，研究者致力于尋找生物中的有效活性物質(zhì)，期望這些活性成分有助于防治代謝綜合征，提高人們的生活質(zhì)量。多糖廣泛存在于植物、動物及微生物中，是指自然界中普遍存在的由許多相同或者不同的單糖以α-糖苷鍵或者β-糖苷鍵組成的化合物，也是構成生物機體的基本物質(zhì)[2]。近幾十年來，人們逐漸認識到多糖在生物體中的功能，絕非僅僅作為能量來源和支持組織結構，更重要的是參與生物合成反應、細胞增殖、病毒和細菌感染、腫瘤細胞轉移、調(diào)節(jié)腸道菌群等生物反應[2]。

隨著認識和研究的深入，越來越多的人認識到多糖研究的重要性，對多糖提取純化以及結構的研究也越來越多。植物多糖相較于動物多糖，前者含量較高，且糖蛋白含量較少，較好分離純化，故植物多糖也就成為研究的熱點。植物多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化和抗腫瘤等生物活性，且自身毒性較小，因此具有廣闊的應用前景?；诖?，本文闡述了植物多糖的提取純化、結構、生物活性幾個方面的研究，以期為植物多糖的進一步研究提供參考。

1? 植物多糖的提取

1.1? 水提醇沉法

其原理是多糖具有大量的羥基，因此容易與水形成氫鍵而溶出，再利用多糖不易與醇類形成氫鍵的特點，加入乙醇使多糖沉淀。這種方法簡單易操作、成本低、污染小，也是一直沿用至今的原因。

1.2? 熱水提取法

熱水提取雖然簡單價廉，但具有提取率低、提取溫度高、提取時間長等缺點，因此，在提取過程中，一般會結合物理或化學方法來輔助提取[3]。荊晶等[4]利用熱水提取結合響應面法優(yōu)化，指出綠茶多糖的提取工藝∶料液比1∶20，提取時間90 min，提取溫度80 ℃，提取率為5.22%。

1.3? 微波/超聲輔助提取

Li S L等[5]采用正交試驗法，對水浸法、微波輔助提取法和超聲提取法分別進行了優(yōu)化。熱水提取方法的優(yōu)化條件為90 ℃下提取3 h，提取3次，液固比為50∶1，多糖的提取率為2.10%;微波輔助提取法的優(yōu)化條件：處理15 min，液固比為50∶1，提取率為4.18%;超聲提取方法的優(yōu)化條件：在60 ℃下超聲30 min，提取2次，液固比為60∶1，頻率為60 Hz，提取率為3.02%。

1.4? 新技術應用

現(xiàn)在一些新技術也被運用到多糖提取中以達到優(yōu)化提取的效果。Li等[5]利用陰離子反向膠束系統(tǒng)提取多糖，發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)條件下（pH值4.6，0.06 mol/L鹽酸胍鹽，7%甲醇和0.05 mol/L NaCl）正向采收率為34%，這種方法傳質(zhì)快、選擇性高、成本較低。Chen等[6]利用超臨界二氧化碳萃取技術，提取時間2 h，萃取溫度45 ℃，提取率高達92.5%。

2? 植物粗多糖的分離純化

多糖提取物一般含有較多的“雜質(zhì)”，其中，多糖提取物中的蛋白質(zhì)一般采用三氯乙酸、三氟三氯乙烷、Sevege法或蛋白酶法來除去，也有文獻中提到幾種方法混用而達到除蛋白的效果[7]。植物多糖提取液顏色較深，需要進行脫色處理，常用的有氧化法、吸附法、離子交換法、金屬絡合物法等[8]。

多糖提取物經(jīng)初步分離后，通常是不同極性、不同相對分子質(zhì)量的多糖混合物，多糖組分不夠均一，還需要進一步純化。多糖純化的方法有很多，如：分級沉淀法、柱層析法、超濾法、反相高效液相色譜等[8-9]。Zhou等[10]采用凝膠G-100來純化茶多糖，使茶多糖的純度從34.5%升高至90.26%。Wang等[11]使用超濾膜分離粗多糖，得到3個餾分，分子量分別為240 kDa、21.4 kDa和2.46 kDa。Wang等[12]以茶花為原料，采用乙醇分級精餾和逐步沉淀法制備茶花多糖，發(fā)現(xiàn)30%的乙醇濃度可使茶花多糖析出最多，接近傳統(tǒng)方法70%乙醇析出的結果。

3? 植物組分多糖的結構解析

多糖結構表征手段很多，包括化學方法、儀器分析法等，但多糖的結構復雜，需要多種方法相結合才能解析出其結構。多糖的一級結構主要研究的是多糖得相對分子質(zhì)量和純度、單糖組成和糖醛酸類型與比例、單糖殘基的絕對構型（D型或L型）、成環(huán)類型、連接順序、連接位點、異頭異構形式等，對應的分析方法見表1。

Zou等[14]闡明了從枸杞中得到的酸性組分多糖（LBP-1）的結構。由高效凝膠滲透色譜（HPGPC）測得其平均相對分子質(zhì)量為2 250 kDa，水解后進行HPLC和GC分析，結果顯示LBP-1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸組成;紅外光譜1H-NMR和13C-NMR特征峰證實了有去質(zhì)子化的半乳糖醛酸存在。

Yuan等[15]結合高效液相色譜（HPLC），傅里葉變換紅外光譜（FTIR），甲基化分析，核磁共振光譜（NMR），發(fā)現(xiàn)其中一組分多糖SCP-1平均分子量為15.63 kDa，主鏈是由α-D-Glcp殘基由（1→4）糖苷鍵連接，側鏈是由α-D-Glcp通過（1→6）糖苷鍵連接主鏈，主鏈上每5個殘基有一個分支點。

Tang等[16]測得組分多糖LBP-3b的相對分子質(zhì)量為4.92 kDa，單糖組成是甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，其中葡萄糖占68%，甘露糖占13%，鼠李糖占12%。通過紫外光譜、紅外光譜和核磁共振對結構進行分析，證明了吡喃環(huán)和呋喃環(huán)的存在，且此組分多糖中含有3.5%的蛋白。

4? 植物多糖生物活性

對于植物多糖生物活性的研究，目前國內(nèi)外文獻主要集中于免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗氧化活性。多糖活性研究的常用技術見表2。

4.1? 免疫調(diào)節(jié)活性

大量免疫實驗證明，多糖不僅能激活吞噬細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞等免疫細胞，還能誘導細胞因子的產(chǎn)生和細胞因子受體的表達，促進抗體形成[17]。Schepetkin等[17]報道純化得到的阿拉伯半聚糖通過誘導小鼠腹膜巨噬細胞J744.A1分泌一氧化氮（NO）合成酶從而刺激細胞產(chǎn)生NO，同時分泌IL-1、IL-6、TNF-α、IL-12等炎癥因子和IL-10抗炎癥因子。Wei等[18]從黃芪中提取的黃芪多糖通過TLR4介導的MAPK和NF-κB的激活誘導RAW 264.7細胞NO及細胞因子的產(chǎn)生，并顯著上調(diào)TNF-α，IL-6，iNOS的基因表達。白術中提取的白術多糖，具有增強巨噬細胞吞噬功能，提高TLR4的表達并可能通過正調(diào)節(jié)MAPK和NF-κB兩條通路，促進細胞因子及生物活性物質(zhì)的釋放來調(diào)節(jié)機體免疫[19]。

4.2? 抗腫瘤活性

多糖的抗腫瘤作用近些年來引起人們廣泛的關注，多糖的抗腫瘤作用方法可分為兩類，一類是具有通過激活機體的免疫系統(tǒng)，誘導細胞分化、抗轉移、抗新生血管生成和誘導NO產(chǎn)生等;另一類是通過抑制腫瘤細胞的蛋白質(zhì)和核酸的合成、誘導腫瘤細胞凋亡、影響癌基因表達來達到抗腫瘤的作用等，抑制腫瘤細胞生長。陳沛等[20]發(fā)現(xiàn)在一定的濃度范圍內(nèi)，GFP能顯著抑制人肝癌HepG2細胞的增殖;經(jīng)過GFP處理的HepG2細胞出現(xiàn)了典型的細胞凋亡的形態(tài)變化，細胞收縮，形成微核，說明GFP誘導HepG2細胞凋亡。Zhou等[21]證實了黃芪多糖可協(xié)同順鉑誘導鼻咽癌細胞的凋亡。李學波等[22]報道香菇多糖可激活老年中晚期消化道惡性腫瘤患者體內(nèi)的補體系統(tǒng)，提高患者免疫功能。

4.3? 降血糖活性

（1）降低肝糖原、提高外周組織器官對糖的利用;（2）促進降糖激素和抑制升高血糖激素的分泌;（3）降低機體的氧化應激作用;（4）具有胰島細胞保護作用及糖代謝酶活力調(diào)節(jié)作用等。Schwede等[23]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可結合G蛋白偶聯(lián)受體，在細胞內(nèi)第二信使的參與下，激活蛋白激酶A、蛋白激酶B和磷脂酰肌醇激酶3發(fā)揮作用，提升胞內(nèi)環(huán)腺苷酸濃度，阻斷鉀離子通道，導致胞外鈣離子內(nèi)流，從而提高機體胰島素水平，降低機體血糖升高。類似地，肖春等[24]發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能夠提高外周組織對糖的利用，增強葡萄糖代謝相關酶的活性，加速葡萄糖的分解，從而實現(xiàn)降血糖的效果。洪德志等[25]發(fā)現(xiàn)桑枝多糖可以調(diào)節(jié)脂類物質(zhì)代謝、增加肝糖原積累、改善胰島素分泌，從而可以有效降低血糖。

4.4? 抗氧化活性

許多種植物多糖均具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制亞油酸氧化等抗氧化作用。多糖的抗氧化活性可能與其抗腫瘤、抗衰老等其他活性的作用機制直接相關。金智生等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在胰島素抵抗（IR）大鼠模型中，紅芪多糖飼喂大鼠與模型組相比SOD活性顯著增強，而丙二醛（MDA）及血糖含量顯著降低，且紅芪多糖高劑量組的作用顯著優(yōu)于紅芪多糖低劑量組，表明紅芪多糖不僅具有抗氧化，治療胰島素抵抗作用，且該作用存在劑量依存性。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)，粗多糖對DPPH清除能力呈濃度依賴性，在25～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)的自由基的清除率為36.58%～86.88%。Ren等[28]研究發(fā)現(xiàn)，富硒茶多糖可顯著提高小鼠肝腎組織SOD和GSH-Px活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，從而減輕糖尿病小鼠因氧化應激產(chǎn)生的胰島組織損傷。

5? 結? 論

多糖因其復雜的結構，賦予其多種生物活性，比如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等。目前，雖然多糖提取、分離、純化的研究已經(jīng)取得較大的進展，但多糖結構復雜，不易于結構表征，因此這部分研究還不夠深入，還需要進一步探索并優(yōu)化分析手段。比如甲基化分析在多糖的結構表征中起著重要的作用，但不易獲得甲基化完全的樣品[29]，因此需要進一步完善甲基化反應，減少副反應發(fā)生。這就需要在完善多糖結構表征方法的基礎上，不斷開發(fā)多糖構效關系的新方法、新手段。另外，對多糖進行分子修飾[30]，可改變多糖的結構和部分理化性質(zhì)，從而改善多糖的活性，故對多糖進行分子修飾是研究多糖構效關系的新方向。

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Investigation on Extraction，Purification，Structural Identification

and Biological Activity of Plant Polysaccharides

Ma Wenying1，Ji Yishun 2

（1.Central Laboratory of Huainan Grain Bureau of Anhui Province，Huainan，Anhui 232046;

2.Anhui Grain and Oil Products Quality Supervision and Testing Station，Hefei，Anhui 230031）

Abstract：Polysaccharides are natural active substances which are extracted from plants.A large number of studies have shown that it has a wide range of biological activities.This paper summarizes the extraction，purification，physicochemical characterization and bioactivities of polysaccharide including immune regulation，antitumor，antidiabetic activity，oxidation biological activity and their corresponding mechanisms.The aim is to provide a reference for the development and utilization of plant polysaccharides.

Keywords：polysaccharides，extraction and purification，structural characterization，biological activity