金橘藥材的UPLC指紋圖譜建立、聚類分析及主成分分析

黃華花 王明軍 黃鳴清 呂詩詩 王圣江

摘 要 目的：建立金橘藥材的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析和主成分分析。方法：采用UPLC法，色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長為330 nm，進(jìn)樣量為2 μL。以金柑苷峰為參照，繪制8批藥材樣品的UPLC指紋圖譜；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰；采用SPSS 24.0軟件對(duì)8批藥材樣品進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果：8批藥材樣品的UPLC指紋圖譜有24個(gè)共有峰，相似度均大于0.97。聚類分析結(jié)果顯示，8批藥材樣品可聚為兩類，S1～S4、S6～S8聚為一類，S5聚為一類。經(jīng)主成分分析，3個(gè)主成分因子的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為81.366%。結(jié)論：所建UPLC指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結(jié)果可為金橘藥材的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞 金橘；超高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度評(píng)價(jià)；聚類分析；主成分分析

Establishment of UPLC Fingerprint， Cluster Analysis and Principal Component Analysis of Fortunella margarita

HUANG Huahua1，WANG Mingjun1，HUANG Mingqing2，LYU Shishi1，WANG Shengjiang1（1. Dept. of Pharmacy， Xiamen Medical College/Fujian Provincial Key Lab of Traditional Chinese Medicine/Fujian Provincial Key Lab of Traditional Chinese Medicine Finish Processing and Health Product Development， Fujian Xiamen 361023， China； 2. College of Pharmacy， Fujian University of TCM， Fuzhou 350122， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish UPLC fingerprint of Fortunella margarita， and to conduct its cluster analysis and principal component analysis. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Acquity UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was set at 330 nm， and sample size was 2 μL. Using fortunellin as reference， UPLC fingerprints of 8 batches of F. margarita were determined. The similarity of 8 batches of samples was evaluated by TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System（2012 edition） to confirm common peak. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 24.0 software. RESULTS： There were 24 common peaks in UPLC fingerprints of 8 batches of sample，the similarity of which was higher than 0.97. Cluster analysis showed that 8 batches of samples were clustered into 2 categories. S1， S2， S3， S4， S6， S7 and S8 were clustered into one category； S5 was clustered into the other category. By principal component analysis， the accumulative contribution rate of three main components was 81.366%. CONCLUSIONS： Established UPLC fingerprint， the results of cluster analysis and principal component analysis can provide reference for quality control of F. margarita.

KEYWORDS Fortunella margarita； UPLC； Fingerprint； Similarity evaluation； Cluster analysis； Principal component analysis

金橘，別名金桔、山橘、金棗、金柑、金彈等，是蕓香科植物金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]的果實(shí)，原產(chǎn)于我國，其中福建尤溪、廣西融安、廣西陽朔、江西遂川、湖南瀏陽和浙江寧波是金橘的六大產(chǎn)區(qū)[1]。金橘藥食同源，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的水果，同時(shí)也具有較高的藥用價(jià)值[2]?！吨腥A本草》記載，金橘性溫，味辛、甘，具有理氣解郁、消食化痰、醒酒之功效，主治胸悶郁結(jié)、脘腹痞脹、食滯納呆、咳嗽痰多、傷酒口渴[3]?，F(xiàn)代研究表明，金橘具有抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[4-5]；除可直接食用或泡水飲用外，市面上還有咸金棗、金棗丹、金桔咀嚼片等相關(guān)制劑[6-7]。目前，金橘藥用方面的研究主要集中在成分分離和藥理活性方面[8-10]，未見質(zhì)量控制方面的報(bào)道及相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。金橘藥材中許多成分的對(duì)照品在市面上購買不到，目前僅有金柑苷對(duì)照品和野漆樹苷對(duì)照品，但僅對(duì)一兩個(gè)成分進(jìn)行含量測(cè)定并不能有效控制金橘藥材的整體質(zhì)量。為此，本研究收集了我國主要產(chǎn)地的金橘藥材樣品，建立了其超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析和主成分分析進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，旨在為有效控制其質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity型 UPLC儀，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、Empower? 3色譜工作站（美國Waters公司）；BS224S型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

金柑苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Q14M10Q73839，純度：>98%）；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；甲醇、磷酸等其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

金橘（編號(hào)：S1～S8）經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系鮑紅娟副教授鑒定為金橘[Fortunella margarita （Lour.） Swingle]的果實(shí)。藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%A→40%A；20～25 min，5%A）；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長：330 nm；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取金柑苷對(duì)照品適量，精密稱定，加75%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為24.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品適量，粉碎，過40目篩，取0.5 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：900 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以金柑苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，24個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.10%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于1.92%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以金柑苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，24個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.28%（n=7），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.84%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材樣品（編號(hào)：S4）0.5 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以金柑苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，24個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.15%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.90%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 UPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 UPLC指紋圖譜的生成 取8批藥材樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)8批藥材樣品指紋圖譜進(jìn)行分析，得UPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），以藥材樣品的UPLC對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，8批藥材樣品的相似度均大于0.97，提示藥材樣品的化學(xué)成分一致性較好，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 8批藥材樣品共有24個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品溶液的UPLC圖（見圖3）比對(duì)，指認(rèn)23號(hào)峰為金柑苷峰。因該峰分離度良好、峰面積大且穩(wěn)定，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其他峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見表3、表4。

2.5 聚類分析

以各共有峰的峰面積除以稱樣量的數(shù)值作為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 24.0軟件，以組間聯(lián)接法結(jié)合平方歐氏距離對(duì)8批藥材樣品進(jìn)行聚類分析，詳見圖4。由圖4可知，8批藥材樣品可聚為兩類，S1～S4、S6～S8聚為一類，S5聚為一類。

2.6 主成分分析

對(duì)8批藥材樣品的24個(gè)共有峰的絕對(duì)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行主成分分析，其特征值和方差貢獻(xiàn)率結(jié)果見表5。由表5可知，共得到3個(gè)主成分因子，特征值分別為10.736、6.067、2.725，方差貢獻(xiàn)率分別為44.732%、25.280%、11.353%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為81.366%。這提示，主成分因子1、2、3可作為金橘藥材的評(píng)價(jià)指標(biāo)，適用于主成分分析。故取主成分因子1、2、3為指標(biāo)對(duì)8批藥材樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，詳見表6、圖5。結(jié)果顯示，8批藥材樣品中S1～S4、S6～S8樣品質(zhì)量較為相近，與S5質(zhì)量差異較大。

3 討論

現(xiàn)代研究表明，金橘具有抗炎鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防結(jié)石、解酒保肝等作用[11-14]，其主要有效成分為黃酮類成分[12，15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，金橘中所含的黃酮類成分包括金柑苷、柚皮素、根皮苷、野漆樹苷、4′-甲氧基-牡荊素-2″-O-α-L-鼠李糖苷、4′-甲氧基-異牡荊素- 2″-O-α-L-鼠李糖苷、蘆丁等[16-18]。筆者參考上述文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)金柑苷為金橘的特征性成分之一，因此選擇金柑苷作為參照峰建立金橘藥材的UPLC指紋圖譜。

本試驗(yàn)比較了乙腈-水、甲醇-水的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)兩種體系中各組分分離度均較好，但采用乙腈-水流動(dòng)相體系時(shí)出峰較快，因此初步選出乙腈-水為流動(dòng)相體系。但試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)一段時(shí)間后，色譜峰出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，而再加入0.1%磷酸可使峰形改善且穩(wěn)定，故最終確定乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。筆者又比較了267、330 nm波長下樣品的色譜行為，發(fā)現(xiàn)在330 nm波長下基線較平穩(wěn)，色譜峰較多，各峰的峰高合適，故選擇330 nm為檢測(cè)波長。

采用50%、75%、100%甲醇分別對(duì)樣品進(jìn)行提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)得到的色譜峰及各峰面積差異不大，但50%甲醇提取時(shí)的樣品溶液濾過困難，又考慮到環(huán)保因素，最終選擇75%甲醇為提取溶劑。同時(shí)，筆者又考察了不同提取時(shí)間（15、30、45 min）對(duì)提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取30 min時(shí)的提取效果較提取15 min好，提取45 min時(shí)與提取30 min無顯著差異，故選擇提取時(shí)間為30 min。

相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，8批藥材樣品的相似度均大于0.97，表明藥材樣品的化學(xué)成分一致性較好；8批樣品24個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD范圍為0～0.31%，相對(duì)峰面積的RSD范圍為0～66.36%，表明不同產(chǎn)地間藥材樣品雖具有相同的化學(xué)成分，但含量存在差異。聚類分析、主成分分析結(jié)果均顯示，8批藥材樣品可聚為兩類，S1～S4、S6～S8聚為一類，S5聚為一類，表明8批藥材樣品中S1～S4、S6～S8樣品質(zhì)量較為相近，與S5質(zhì)量差異較大。該結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果一致，其原因可能與藥材的產(chǎn)地、采集時(shí)間、植株生長年份不同有關(guān)。

綜上所述，本研究所建UPLC指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結(jié)果可為金橘藥材的質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2019-01-10 修回日期：2019-04-23）

（編輯：陳 宏）