采用基因芯片技術(shù)研究丹紅注射液對急性心肌梗死模型大鼠基因表達(dá)譜的影響

施洋 樊官偉 候?qū)毩? 樊登峰 張偉 魯西亮 陳曉黎 何敏

中圖分類號 R285.5;R966 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）22-3042-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.04

摘 要 目的：探討丹紅注射液（DHI）對急性心肌梗死（AMI）模型大鼠基因表達(dá)譜的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和DHI組（0.76 mL/kg），每組10只。模型組和DHI組采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法復(fù)制AMI模型。造模后，假手術(shù)組和模型組大鼠均肌內(nèi)注射等容生理鹽水，DHI組大鼠肌內(nèi)注射相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)14 d。末次給藥后，分離大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織，采用基因芯片技術(shù)檢測基因表達(dá)譜的變化情況，以相對表達(dá)量差異倍數(shù)為指標(biāo)，篩選差異表達(dá)微RNA（miRNA）。在檢索其對應(yīng)基因的基礎(chǔ)上，利用DAVID生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫和KEGG通路數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行基因本體（GO）和KEGG通路富集分析;借助TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異表達(dá)miRNA對應(yīng)的靶基因信使RNA（mRNA），采用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建miRNA- mRNA網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析，采用Agilent GeneSpring GX v11.5軟件篩選上述網(wǎng)絡(luò)中與炎癥相關(guān)的靶基因和miRNA。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組差異表達(dá)miRNA共22個，其中上調(diào)5個、下調(diào)17個;與模型組比較，DHI組差異表達(dá)miRNA共26個，均為上調(diào);與DHI治療AMI有關(guān)的差異表達(dá)miRNA包括rno-let-7a-5p、rno-let-7d-5p、rno-let-7f-5p、rno-miR-26b-5p、rno-miR-29b-3p、cel-miR- 39-3p、cel-miR-39-5p、rno-miR-142-5p、rno-miR-191a-5p、rno-miR-409a-3p。GO和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)miRNA對應(yīng)基因主要集中在膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)膜系統(tǒng)等細(xì)胞組分中，通過解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、多細(xì)胞組織發(fā)育、發(fā)育過程等生物過程來發(fā)揮蛋白結(jié)合、離子結(jié)合等分子功能;其主要富集于鈣信號通路，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路，細(xì)胞凋亡，糖基磷脂酰肌醇錨定生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解等信號通路上。miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，與差異表達(dá)miRNA對應(yīng)的靶基因mRNA共25個，與之關(guān)聯(lián)的miRNA共24個;該網(wǎng)絡(luò)中與炎癥相關(guān)的靶基因共6個（IL6、IL1b、TNF、TLR4、CRP、CXCL12），涉及差異表達(dá)miRNA共19個。結(jié)論：DHI對AMI的治療作用可能與調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA的表達(dá)，影響鈣離子、PPAR、VEGF等通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控白細(xì)胞介素、趨化因子、C反應(yīng)蛋白等炎癥標(biāo)志物的分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞 基因芯片技術(shù);丹紅注射液;急性心肌梗死;差異表達(dá);微RNA;信使RNA;信號通路;炎癥;大鼠

Study on the Effects of Danhong Injection on Gene Expression Profile of Acute Myocardial Infarction Model Rats by Gene Chip Technique

SHI Yang1，2，3，F(xiàn)AN Guanwei3，4，HOU Baolin1，2，F(xiàn)AN Dengfeng1，2，ZHANG Wei1，LU Xiliang1，CHEN Xiaoli1，HE Min2（1. Dept. of Pharmacy， Karamay Municipal Peoples Hospital， Xinjiang Karamay 834000， China; 2. Dept. of Pharmacy， Karamay Hospital of TCM， Xinjiang Karamay 834000， China; 3. Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine/State Key Lab Breeding Base， Tianjin 300193， China; 4. Medical Experiment Center， the First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM， Tianjin 300193， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the effects of Danhong injection （DHI） on gene expression profile of acute myocardial infarction （AMI） model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group and DHI group （0.76 mL/kg）， with 10 rats in each group. AMI model was established by ligation of left anterior descending coronary artery in model group and DHI group. After modeling， sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intramuscularly， and DHI group was given relevant medicine intramuscularly， once a day， for consecutive 14 days. After last administration， myocardial tissue in the marginal zone of infarction was separated. The change of gene expression profile was detected by gene chip technique. Using fold-change of relative expression as index， differentially expressed microRNA （miRNA） were screened. On the basis of retrieving their corresponding genes， gene ontology （GO） and KEGG pathway enrichment analysis were carried out by using DAVID bioinformatics resource database and KEGG pathway database， respectively. TargetScan database was used to predict the target gene messenger RNA （mRNA） corresponding to differentially expressed miRNA. Cytoscape 3.6.1 software was used to construct and analyze the miRNA-mRNA network. Agilent GeneSpring GX v11.5 software was used to screen target genes and miRNA related to inflammation in the above networks. RESULTS： Compared with sham operation group， there were 22 differentially expressed miRNAs in model group， 5 up-regulated and 17 down-regulated. Compared with model group， there were 26 differentially expressed miRNAs in DHI group， and all of them were up-regulated. The differentially expressed miRNAs related to DHI therapy for AMI included rno-let-7a-5p， rno-let-7d-5p， rno-let-7f-5p， rno-miR-26b-5p， rno-miR-29b-3p， cel-miR-39-3p， cel-miR-39-5p， rno-miR-142-5p， rno-miR-191a-5p， rno-miR-409a-3p. Results of GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis showed that differentially expressed miRNAs were mainly concentrated in membrane-bound organelles， cytoplasm， endometrial system and other cell components. The molecular functions such as protein binding and ion binding were exerted through biological processes such as anatomical structure development， multicellular tissue development and development process，which were mainly enriched in calcium signaling pathway， PPAR signaling pathway， VEGF signaling pathway， cell apoptosis， glycosylphosphatidylinositol anchored biosynthesis， valine， leucine and isoleucine degradation， etc. miRNA-mRNA network analysis showed that there were 25 target gene mRNAs corresponding to differentially expressed miRNA and 24 miRNAs related to it. There were 6 inflammation-related target genes （IL6， IL1b， TNF， TLR4， CRP， CXCL12） in this network， involving 19 differentially expressed miRNAs. CONCLUSIONS： The therapeutic effect of DHI on AMI may be related to regulating the expression of related miRNA， affecting signal transduction of calcium ion， PPAR and VEGF pathways， and regulating the secretion of inflammatory markers such as interleukin， chemokine and C-reactive protein.

KEYWORDS ? Gene chip technique; Danhong injection; Acute myocardial infarction; Differential expression; MicroRNA; Messenger RNA; Signaling pathway; Inflammation; Rat

急性心肌梗死（AMI）是臨床上常見的急危重癥，屬急性冠脈綜合征（ACS）的嚴(yán)重類型，是心血管疾病中最主要的致死因素之一[1]。該病既往常見于歐美發(fā)達(dá)國家，據(jù)一項為期26年的隨訪研究顯示，美國35～84歲中老年人群中AMI的男性發(fā)病率為71‰，女性為22‰;每年約有150萬人新發(fā)AMI，45萬人發(fā)生再次心肌梗死[2]。受社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人口老齡化加劇、飲食習(xí)慣改變、心理狀態(tài)變化等因素的影響，我國AMI的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[3]。該病發(fā)病機(jī)制主要是冠狀動脈粥樣硬化形成不穩(wěn)定的粥樣斑塊潰破，繼而引發(fā)出血和管腔內(nèi)血栓形成，從而使管腔閉塞，且通常是由一支或多支血管發(fā)生阻塞而側(cè)支循環(huán)尚未充分建立所造成的心肌缺血缺氧，最終導(dǎo)致患者心肌大面積壞死，這一過程與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4]。為防止梗死范圍擴(kuò)大，縮小缺血面積以挽救瀕死心肌是AMI治療的重要環(huán)節(jié);此外，消除炎癥反應(yīng)等各種不利因素的影響以避免心功能的持續(xù)惡化，也日益成為臨床關(guān)注的焦點之一[5-6]。

丹紅注射液（DHI）是在傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)下結(jié)合現(xiàn)代制藥技術(shù)制成的中藥注射劑，由丹參和紅花兩味中藥組成，具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)之功效，可用于臨床治療瘀血閉阻所致的胸痹、中風(fēng)以及冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦血栓等癥[7-8]。AMI發(fā)生后，機(jī)體內(nèi)多種基因[如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等的編碼基因]的表達(dá)均發(fā)生改變，其中微RNA（miRNA）的變化備受學(xué)者關(guān)注[9]。miRNA可通過調(diào)節(jié)靶信使RNA（mRNA）的翻譯過程來調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等一系列生物學(xué)效應(yīng)[10]。有研究指出，AMI發(fā)生后，機(jī)體內(nèi)多種miRNA表達(dá)水平發(fā)生變化，并參與AMI的進(jìn)展，從而影響患者的治療結(jié)局[11-12]。目前，對于AMI發(fā)生后miRNA的作用類型及具體機(jī)制尚處于初始研究階段，且中藥干預(yù)AMI的作用機(jī)制及靶點亦未完全明確。鑒于此，本研究通過建立AMI大鼠模型，利用基因芯片技術(shù)分析DHI對其心肌梗死邊緣區(qū)基因表達(dá)譜的影響;在篩選差異表達(dá)miRNA的基礎(chǔ)上，從基因功能、信號通路等方面挖掘DHI對AMI的潛在調(diào)控機(jī)制，并初步探討該藥對炎癥反應(yīng)的可能影響，以期為DHI作用機(jī)制闡釋及其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

MP-150型多導(dǎo)生理記錄儀（美國BioPac公司）;ALC-V8型小動物呼吸機(jī)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;STEMI2000-C型體視顯微鏡（德國Zeiss公司）;Microfuge22R型冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）;CFX96型實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;E-espect型吸光-熒光光度計（日本Malcom公司）;G2939A 2100型生物分析儀（美國Agilent公司）;NanoDrop2000型分光光度計（美國Thremo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

DHI（菏澤步長制藥有限公司，批號：17121030，規(guī)格：每支裝10 mL）;注射用青霉素鈉[石家莊制藥集團(tuán)有限公司，批號：017140617，規(guī)格：0.96 g（160萬單位）];QIAzol Lysis組織樣本裂解試劑（批號：79306）、miRNA純化試劑盒miRNeasy Mini Kit（批號：217004）、miRNA定量檢測試劑盒miScript Ⅱ RT Kit（批號：218161）、設(shè)置和優(yōu)化的miRNA定量檢測試劑盒miScript PCR Starter Kit（批號：218193）、miRNA定量檢測試劑盒miScript SYBR? Green PCR Kit（批號：218073）、miRNA表達(dá)譜分析試劑盒miScript miRNA PCR Arrays（批號：331231）均購自德國Qiagen公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量220～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0008。所有大鼠均飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心清潔級動物房內(nèi)，溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，每12 h交替明暗環(huán)境，每2 d更換1次墊料。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和DHI組，每組10只。模型組和DHI組大鼠采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法復(fù)制AMI模型：大鼠麻醉后，將胸前及頸部皮膚備皮并消毒，沿頸部正中切開，牽拉周圍肌肉暴露氣管。將靜脈鞘管針帶芯插入氣管內(nèi)，拔出針芯，連接小動物呼吸機(jī)進(jìn)行輔助呼吸（呼吸頻率：80次/min，潮氣量：4 mL，呼吸比：1 ∶ 1）并記錄心電圖。于3、4肋間隙作一斜行長約1.5 cm的切口，逐層鈍性分離肌肉，撐開胸腔，暴露心臟。在體視顯微鏡下剝離心包膜并尋找肺動脈圓錐和左心耳，于兩者交界且距冠狀動脈起始點下方1～2 mm處進(jìn)針，深度1.0～1.5 mm，以6/0號縫合線結(jié)扎。若大鼠心電圖呈S-T段弓背上抬、T波高聳、QRS波電壓增高伴波幅增寬則判定造模成功[13]。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉（40萬單位，每日1次，連續(xù)3 d）以預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎，其余操作同上。造模成功后，DHI組大鼠肌內(nèi)注射DHI（0.76 mL/kg，劑量根據(jù)臨床用量并結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果[14]換算而得），假手術(shù)組和模型組大鼠均肌內(nèi)注射生理鹽水（0.76 mL/kg），每日1次，連續(xù)14 d。

2.2 組織取材

末次給藥2 h后，以頸椎脫臼法處死大鼠。取出心臟，剪開右心耳，經(jīng)腹主動脈用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.2～7.4）清洗2次，每次50 mL。保留左心室游離壁部分，剪去發(fā)白梗死區(qū)，取梗死邊緣區(qū)心肌組織約50 mg，用錫箔紙包裹后，放入凍存管中，于液氮中速凍30 min后，轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存，待檢。

2.3 總RNA提取和純化

使用QIAzol Lysis組織樣本裂解試劑裂解大鼠心肌梗死邊緣區(qū)組織，以異丙醇沉淀法[15]提取其總RNA;使用miRNeasy Mini Kit試劑盒按其說明書方法進(jìn)行純化。

2.4 miRNA基因芯片檢測

采用分光光度計分別于260、280 nm波長處檢測總RNA的吸光度（A），若其A260 nm/A280 nm值為1.8～2.0則表明RNA純度較高[16]。采用生物分析儀對總RNA進(jìn)行凝膠電泳分析，通過對比電泳條帶灰度值來計算總RNA的分子完整數(shù)（RIN）及28S/18S，若其RIN≥7且28S/18S≥0.7即為合格RNA[17]，可進(jìn)行后續(xù)試驗。應(yīng)用miScript Ⅱ RT Kit對包含miRNA的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，參照miScript PCR Starter Kit試劑盒說明書設(shè)置和優(yōu)化miRNA的定量分析，采用miScript SYBR? Green PCR Kit對miRNA進(jìn)行檢測，采用miScript miRNA PCR Arrays對miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析。上述試驗平行操作3次，芯片數(shù)據(jù)匯總、分析由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

2.5 差異表達(dá)miRNA篩選及分析

將假手術(shù)組、模型組、DHI組進(jìn)行兩兩匹配，即假手術(shù)組與模型組、模型組與DHI組。采用RT-PCR法以實時RT-PCR儀分析上述各組樣品miRNA的表達(dá)情況，引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件均參照miScript SYBR? Green PCR Kit試劑盒說明書，采用2-ΔΔCt法計算并定量分析其相對表達(dá)量（Ct值為每個樣品的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。同時，將所得Ct值導(dǎo)入MiRNA在線分析軟件（http：//pcrdataanalysis.sabiosciences.com/mirna）中進(jìn)行分析，將相對表達(dá)量差異倍數(shù)（Fold- change）≥1.5且P<0.05的miRNA定義為差異表達(dá)miRNA[18]。對上調(diào)、下調(diào)的miRNA進(jìn)行匯總、分析，并在分組比較的基礎(chǔ)上，篩選與DHI治療AMI有關(guān)的差異表達(dá)miRNA。

2.6 基因本體（GO）分析

借助miRBase數(shù)據(jù)庫（https：//www.mirbase.org）檢索“2.5”項下所得差異表達(dá)miRNA的對應(yīng)基因，并以此為對象，利用DAVID生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）進(jìn)行GO分析，獲知其潛在作用靶點的功能分布及富集程度。其中，功能分布包括分子功能、生物過程和細(xì)胞組分等3個方面;富集程度以富集度（即歸類聚集程度，以轉(zhuǎn)錄域覆蓋率表示）為指標(biāo)，以正負(fù)值分別表示對應(yīng)上調(diào)或下調(diào)靶點，其絕對值越大表明富集度越高[19]。分析結(jié)果采用WEGO 2.0軟件處理，并以富集條形圖展示。

2.7 KEGG通路富集分析

以“2.6”項下所得差異表達(dá)miRNA的對應(yīng)基因為對象，利用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp）進(jìn)行KEGG通路富集分析，富集程度以P值表示，其值越小表明其生物學(xué)富集途徑越顯著[20]。分析結(jié)果采用TBtools 0.6656軟件處理，并以富集條形圖展示。

2.8 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析

借助TargetScan數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/）預(yù)測差異表達(dá)miRNA（包括與AMI發(fā)生以及DHI治療有關(guān)的全部miRNA）的靶基因mRNA，并運用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，對差異表達(dá)miRNA與目標(biāo)基因之間的相互關(guān)系進(jìn)行可視化展示;同時，應(yīng)用Agilent GeneSpring GX v11.5軟件篩選上述網(wǎng)絡(luò)中與炎癥相關(guān)的靶基因，以此挖掘與AMI發(fā)生后炎癥反應(yīng)調(diào)控有關(guān)的miRNA。上述分析由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

2.9 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，導(dǎo)入RT2 Profiler qPCR Array System在線分析軟件（http：//www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php）進(jìn)行分析。采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以 x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 差異表達(dá)miRNA篩選分析結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組差異表達(dá)miRNA共22個，其中表達(dá)上調(diào)5個、下調(diào)17個，詳見表1（表中，“rno”表示大鼠，“cel”表示細(xì)胞，下同）。與模型組比較，DHI組差異表達(dá)miRNA共26條，均為表達(dá)上調(diào)，詳見表2。由表1、表2可見，與DHI治療AMI有關(guān)的差異表達(dá)miRNA包括rno-let-7a-5p、rno-let-7d-5p、rno-let-7f-5p、rno- miR-26b-5p、rno-miR-29b-3p、cel-miR-39-3p、cel-miR-39- 5p、rno-miR-142-5p、rno-miR-191a-5p、rno-miR-409a-3p。

3.2 差異表達(dá)miRNA對應(yīng)基因GO分析結(jié)果

差異表達(dá)miRNA對應(yīng)基因主要集中在膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)膜系統(tǒng)等細(xì)胞組分中，通過解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、多細(xì)胞組織發(fā)育、發(fā)育過程等生物過程來發(fā)揮蛋白結(jié)合、離子結(jié)合等分子功能，詳見圖1。

綜上所述，DHI對AMI的治療作用可能是通過調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA的表達(dá)，影響鈣離子、PPAR、VEGF等通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控IL、TNF、CXCL、TLR、CRP等炎癥標(biāo)志物的分泌等途徑來實現(xiàn)的。但本結(jié)論尚有待更多基礎(chǔ)研究予以進(jìn)一步驗證。

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（收稿日期：2019-03-01 修回日期：2019-08-01）

（編輯：張元媛）