依達(dá)拉奉對(duì)海水淹溺性大鼠急性肺損傷治療作用的影響

陳卓 山淇 李宏

[摘要] 目的 觀察依達(dá)拉奉對(duì)海水淹溺性大鼠急性肺損傷的治療作用，并探討其作用機(jī)制。 方法 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將40只健康雄性SD大鼠分為空白對(duì)照組（C組）、依達(dá)拉奉組（E組）、海水淹溺組（S組）和治療組（SE組），每組10只。氣管內(nèi)注入人工海水建立動(dòng)物模型：C組暴露氣管后尾靜脈注射2 mL/kg生理鹽水;E組暴露氣管后尾靜脈注射2 mL/kg依達(dá)拉奉注射液;S組暴露氣管后于氣管內(nèi)注入4 mL/kg人工海水+尾靜脈注入2 mL/kg生理鹽水;SE組暴露氣管后于氣管內(nèi)注入4 mL/kg人工海水+尾靜脈注入2 mL/kg依達(dá)拉奉注射液。造模6 h后處死大鼠，檢測(cè)各組大鼠肺組織濕/干比、支氣管肺泡灌洗液蛋白含量、血清白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量和肺組織病理改變;RT-PCR及Western blot檢測(cè)水通道蛋白（AQP）1和AQP5 mRNA及蛋白表達(dá)量。 結(jié)果 S組大鼠肺組織濕干比明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠肺組織濕干比低于S組（P < 0.05）。S組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量低于S組（P < 0.05）。S組和SE組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α含量均明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯低于S組，血清IL-10含量明顯高于S組（P < 0.05）。S組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達(dá)量高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達(dá)量低于S組（P < 0.05）。 結(jié)論 依達(dá)拉奉可通過(guò)調(diào)節(jié)AQP1和AQP5的表達(dá)減輕海水淹溺造成的急性肺損傷。

[關(guān)鍵詞] 依達(dá)拉奉;淹溺;急性肺損傷;水通道蛋白

[中圖分類(lèi)號(hào)] R-332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）08（b）-0016-05

[Abstract] Objective To observe the therapeutic effect of Edaravone on acute lung injury in seawater drowning rats and explore its mechanism. Methods Forty healthy male SD rats were divided into control group （group C）， Edaravone group （group E）， seawater drowning group （group S） and treatment group （group SE） according to random number table method， with 10 rats in each group. Artificial seawater was injected into trachea to establish animal models： group C was injected with 2 mL/kg saline via tail vein after tracheal exposure; group E was injected with 2 mL/kg Edaravone injection via tail vein after tracheal exposure; group S was injected with 4 mL/kg artificial seawater after tracheal exposure + 2 mL/kg saline via tail vein; group SE was injected with 4 mL/kg artificial saline via trachea after tracheal exposure + 2 mL/kg Edaravone injection via tail vein. Six hours after the establishment of the model， rats were killed. The wet/dry weight ratio， protein concentration in bronchoalveolar lavage fluid， interleukin （IL）-6， IL-10， serum tumor necrosis factor-α （TNF-α） content and pathological changes of lung tissue were detected. The mRNA and protein expression of aquaporin （AQP）-1 and AQP5 were detected by RT-PCR and Western blot. Results The wet-dry ratio of lung tissue in group S was significantly higher than that in group C （P < 0.05）， and that in group SE was lower than that in group S （P < 0.05）. The protein content of bronchoalveolar lavage fluid in group S was significantly higher than that in group C （P < 0.05）; the protein content of bronchoalveolar lavage fluid in group SE was lower than that in group S （P < 0.05）. The serum levels of IL-6， IL-10 and TNF-α in group S and SE were significantly higher than those in group C （P < 0.05）; the serum levels of IL-6 and TNF-α in group SE were significantly lower than those in group S， and the serum level of IL-10 was significantly higher than that in group S （P < 0.05）. The expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue of rats in group S was higher than that in group C （P < 0.05）; the expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue of rats in group SE was lower than that in group S （P < 0.05）. Conclusion Edaravone can alleviate the acute lung injury caused by seawater drowning by regulating the expression of AQP1 and AQP5.

[Key words] Edaravone; Drowning; Acute lung injury; Aquaporin

近年來(lái)，隨著海洋領(lǐng)域軍事、商業(yè)和娛樂(lè)活動(dòng)的逐漸頻繁，全球范圍內(nèi)因淹溺導(dǎo)致死亡的人數(shù)逐年升高，已經(jīng)成為最常見(jiàn)的意外死亡原因之一[1]。相關(guān)研究證實(shí)，淹溺后海水吸入肺內(nèi)，形成淹溺性急性肺損傷（SW-ALI），直至發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征，導(dǎo)致死亡[2]。在臨床上，目前尚無(wú)有效方法治療SW-ALI，在機(jī)械通氣的基礎(chǔ)上，使用有效的藥物抗炎治療，可減輕肺損傷[3-4]。依達(dá)拉奉作為一種新型自由基清除劑[5]，在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，并取得了良好的療效[6-7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉可以緩解缺血再灌注和內(nèi)毒素所引起的急性肺損傷[8-9]。然而，其對(duì)SW-ALI治療作用的研究目前仍鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建海水SW-ALI動(dòng)物模型，觀察依達(dá)拉奉對(duì)SW-ALI的作用，并初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

依達(dá)拉奉注射液（福建天泉藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：H20110090，每支15 mg，10 mL），腫瘤壞死因子α（TNF-α，南京建成科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180603），白細(xì)胞介素-6（IL-6，南京建成科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180529），白細(xì)胞介素-10（IL-10，南京建成科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180605），ELISA試劑盒（南京建成科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：CW2569M），熒光定量試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：CW2601M）。人工海水配制：根據(jù)國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的東南沿海海水主要成分：氯化鈉26.518 g/L，硫酸鎂3.305 g/L，氯化鎂2.447 g/L，氯化鈣1.141 g/L，氯化鉀0.725 g/L，碳酸氫鈉0.202 g/L，溴化鈉0.083 g/L;滲透壓1300 mmol/L，pH 8.2，相對(duì)密度1.05。海水現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量220～260 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0006]。本研究經(jīng)武警部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為四組，即：空白對(duì)照組（C組）、依達(dá)拉奉組（E組）、海水淹溺組（S組）和治療組（SE組），每組10只。氣管內(nèi)注入4 mL/kg人工海水建立動(dòng)物模型：C組暴露氣管后尾靜脈注射2 mL/kg生理鹽水;E組暴露氣管后尾靜脈注射2 mL/kg依達(dá)拉奉注射液;S組暴露氣管后于氣管內(nèi)注入4 mL/kg人工海水造模，隨后尾靜脈注入2 mL/kg生理鹽水;SE組暴露氣管后于氣管內(nèi)注入4 mL/kg人工海水造模，隨后尾靜脈注入2 mL/kg依達(dá)拉奉注射液。6 h后處死大鼠，收集組織標(biāo)本。

1.3 肺組織病理學(xué)檢查

每組大鼠取相同部位肺組織，4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋和切片，進(jìn)行HE染色并觀察肺組織病理變化。

1.4 肺組織濕干比測(cè)定

每組大鼠取相同肺葉，擦拭表面水分及血跡后，立即電子天平稱(chēng)重，記為濕重，再將肺葉放入70℃烤箱中72 h，至恒定重量，記為干重，并計(jì)算濕干比。

1.5 支氣管肺泡灌洗液蛋白含量測(cè)定

打開(kāi)胸腔，結(jié)扎右主支氣管，用特制的氣管插管插入左主支氣管，用生理鹽水4 mL緩慢注入左肺中，并輕柔肺部使生理鹽水在肺部均勻分布，重復(fù)灌洗3次，回收支氣管肺泡灌洗液，后4℃離心，取上清液用BCA法測(cè)蛋白含量。

1.6 血清IL-6、IL-10和TNF-α檢測(cè)

采用ELISA檢測(cè)血清IL-6、IL-10和TNF-α含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)水通道蛋白（AQP）1、AQP5 mRNA表達(dá)量

首先，Trizol法提取肺組織標(biāo)本RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度;然后，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增AQP1和AQP5，以β-actin為內(nèi)參照。各引物序列均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，AQP1基因：上游為5′-TCTGGAGGC-TGTGGTGGCT-3′，下游為5′-AAGTGAGTTCTCGAG-CAGGGA-3′;AQP5基因：上游為5′-TGGGTCTTCTG-GGTAGGGCCTATTGT-3′，下游為5′-GCCGGCTTTGGCACTTGAGATACT-3′;β-actin：上游為5′-ATCTGGCACCACACCTTC-3′，下游為5′-AGCCAGGTCCAG-ACGCA-3′。擴(kuò)增條件為：95℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)，自動(dòng)4℃保存。采用2-ΔΔct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.8 Western blot檢測(cè)AQP1和AQP5蛋白表達(dá)量

取適量肺組織，加入蛋白裂解液勻漿，離心收集上清液，獲得肺組織蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白。將標(biāo)記的膜放入1%的脫脂奶粉封閉液中，并在室溫緩慢振蕩2 h;一抗按1∶1000稀釋加入，4℃搖床震蕩過(guò)夜，TBST洗膜;加入二抗，37℃溫育2 h，再次洗滌;將膜在暗室滴上發(fā)光液，避光保存并照相，結(jié)果做灰度掃描分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較

肺組織大體標(biāo)本觀察：C組與E組大鼠肺組織表面光滑、完整;S組大鼠肺組織可見(jiàn)水腫明顯，表面可見(jiàn)散在點(diǎn)、片狀出血灶;SE組大鼠肺組織標(biāo)本可見(jiàn)輕微水腫，表面偶見(jiàn)點(diǎn)狀出血灶。肺組織HE染色后觀察（圖1）：C組與E組大鼠肺組織無(wú)明顯病理改變;S組大鼠肺組織出現(xiàn)典型的急性肺損傷病理改變，可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)性水腫，肺泡間隔增厚，斑片狀出血灶;SE組大鼠與S組比較，肺組織間質(zhì)性水腫程度減輕，出血灶減少，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。

2.2 四組大鼠肺組織濕干比結(jié)果比較

S組大鼠肺組織濕干比明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠肺組織濕干比低于S組（P < 0.05）;C組與E組大鼠肺組織濕干比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 四組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量比較

S組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量低于S組（P < 0.05）;C組與E組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 四組大鼠血清細(xì)胞因子含量比較

S組和SE組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α含量均明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯低于S組，血清IL-10含量明顯高于S組（P < 0.05）;C組與E組大鼠血清細(xì)胞因子含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.5 四組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達(dá)量比較

S組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達(dá)量均高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達(dá)量低于S組（P < 0.05）;C組與E組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討論

近年來(lái)隨著開(kāi)發(fā)海洋資源活動(dòng)的逐漸頻繁，海水淹溺事故也逐漸增多。全世界每年約有37.2萬(wàn)人因溺水導(dǎo)致死亡[10]。海水是一種高滲、低溫的液體[11]，吸入海水后，高滲透壓和低溫共同作用于肺組織，破壞肺泡結(jié)構(gòu)，引起炎性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SW-ALI模型大鼠肺泡毛細(xì)血管膜的通透性增加，肺水腫程度增高，炎性因子聚集，呈現(xiàn)急性肺損傷的病理改變，這是由于高滲透壓的海水可導(dǎo)致肺間質(zhì)和肺泡毛細(xì)血管中液體滲漏至肺泡中，形成肺水腫和低氧血癥[12]。同時(shí)肺水腫引起肺泡-毛細(xì)血管膜的通透性增高，進(jìn)一步導(dǎo)致周?chē)后w滲漏至肺泡中，加重支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，同時(shí)大量炎性介質(zhì)釋放并進(jìn)一步損害肺組織[13]。依達(dá)拉奉由于具有抗氧化和抗自由基的作用，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于急性腦卒中和腦水腫的治療[14-16]。若將其用于SW-ALI的治療，能否發(fā)揮同樣的效果，有待探討。本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用依達(dá)拉奉后，可見(jiàn)一方面通過(guò)下調(diào)血清促炎因子TNF-α、IL-6及上調(diào)血清抑炎因子IL-10的表達(dá)，改善海水淹溺后肺部炎性反應(yīng);另一方面通過(guò)降低肺泡毛細(xì)血管通透性，抑制肺水腫的形成，除了已知的抗氧化作用外，是否還影響了其他通路相關(guān)蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮治療作用，有待進(jìn)一步研究，為此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了肺組織AQP的表達(dá)。

AQP是一組廣泛分布于生物細(xì)胞膜上具有調(diào)節(jié)水分子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的內(nèi)在蛋白[17]。在人類(lèi)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的AQP至少有12種，在肺組織中主要有6種AQP表達(dá)，包括AQP1、AQP3、AQP5、AQP8、AQP9。有研究證實(shí)，AQP1和AQP5與肺組織內(nèi)水分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有著密切的關(guān)系[18]。因此，推測(cè)依達(dá)拉奉改善肺水腫的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AQP1和AQP5的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，海水淹溺后可促進(jìn)AQP1和AQP5的表達(dá)，而依達(dá)拉奉可抑制AQP1和AQP5的表達(dá)。有研究表明，急性高原缺氧引起的肺水腫和海水淹溺引起的肺損傷中AQP1和AQP5的表達(dá)上調(diào)[19]。She等[20]發(fā)現(xiàn)通過(guò)敲除小鼠AQP5基因可增加高原型肺水腫損傷程度，提示AQP可能參與了急性肺損傷肺水腫形成的病理過(guò)程，這對(duì)研究肺水腫的發(fā)生機(jī)制提供了新的思路。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建SW-ALI模型，探討依達(dá)拉奉對(duì)SW-ALI的治療效果，并基于AQP進(jìn)一步探索其治療機(jī)制，發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉在改善肺部炎癥的同時(shí)，可能通過(guò)降低AQP1和AQP5水平，調(diào)節(jié)肺內(nèi)水分的分布，緩解肺水腫，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)SW-ALI的治療作用，為臨床上治療SW-ALI提供了新的思路。

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（收稿日期：2019-01-22? 本文編輯：李亞聰）