EB病毒基因片段表達水平與鼻咽癌發(fā)病的關(guān)系

劉潔瓊 曹永清 李科 齊慧

[摘要] 目的 探討B(tài)CRF-1 mRNA表達水平與鼻咽癌發(fā)病相關(guān)性及其對免疫功能的影響。 方法 選取2017年1月～2018年5月于長沙市第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的54例鼻咽癌患者（鼻咽癌組）作為研究對象，選取我院同期就診的50例非腫瘤性鼻咽患者作為對照組。采用實時熒光定量PCR檢測BCRF-1 mRNA的表達水平，采用流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群。 結(jié)果 與對照組比較，鼻咽癌組BCRF-1 mRNA相對表達顯著升高（P < 0.05）;TNM分期T3～T4期、N2～N3期鼻咽癌BCRF-1 mRNA相對表達量明顯高于T1～T2期、N0～N1期（P < 0.05）;BCRF-1 mRNA高表達組CD4+T細胞比例和CD4+/CD8+明顯低于BCRF-1 mRNA低表達組，而CD8+T細胞比例明顯高于BCRF-1 mRNA低表達組（均P < 0.05）。 結(jié)論 BCRF-1 mRNA表達可能與鼻咽癌TNM分期T、N有關(guān)，同時其高表達對患者免疫功能有抑制作用。

[關(guān)鍵詞] BCRF-1 mRNA;鼻咽癌;EB病毒;免疫功能;臨床病理特征

[中圖分類號] R730.231? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）09（b）-0113-04

Relationship between the expression level of EB virus gene fragment and the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma

LIU Jieqiong? ?CAO Yongqing? ?LI Ke? ?QI Hui

Department of Hematology and Oncology， the First Hospital of Changsha， Hu'nan Province， Changsha? ?410005， China

[Abstract] Objective To explore the correlation of BCRF-1 mRNA expression with nasopharyngeal carcinoma and its influence on immune function. Methods A total of 54 patients with nasopharyngeal carcinoma （nasopharyngeal carcinoma group） who were admitted to the First Hospital of Changsha （“our hospital” for short） from January 2017 to May 2018 were enrolled in the study. At the same time， 50 cases of non-neoplastic nasopharyngeal patients treated at the same time in our hospital were selected as the control group. The expression of BCRF-1 mRNA was detected by real-time PCR， the T cell subsets were determined by flow cytometry. Results Compared with control group， the relative expression of BCRF-1 mRNA was significantly increased （P < 0.05）. And the relative expression of BCRF-1 mRNA in TNM stage T3-T4 and N2-N3 was significantly higher than that in TNM stage T1-T2 and N0-N1 stage （P < 0.05）. The percentage of CD4+ T cells and CD4+/CD8+ in the high expression of BCRF-1 mRNA group was significantly lower than that in the low expression of BCRF-1 mRNA group， while the proportion of CD8+ T cells was significantly higher than that in the low expression of BCRF-1 mRNA group （all P < 0.05）. Conclusion The expression of BCRF-1 mRNA are may be related to TNM stage T and N of nasopharyngeal carcinoma， and its high expression can inhibit the immune function of patients.

[Key words] BCRF-1 mRNA; Nasopharyngeal carcinoma; EB virus; Immune function; Clinicopathological features

流行病學(xué)研究證實，我國部分地區(qū)2010～2016年鼻咽癌的發(fā)病可達283/10萬人～482/10萬人[1]。臨床上鼻咽癌能夠?qū)е逻h處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，增加腫瘤患者的病死率風(fēng)險，縮短患者總體生存時間[2-3]。在探討鼻咽癌發(fā)病機制的過程中發(fā)現(xiàn)不同的基因或者腫瘤相關(guān)蛋白的表達，能夠通過影響鼻黏膜上皮細胞的生物學(xué)特征，干預(yù)自身免疫監(jiān)察作用，進而影響鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的過程。EB病毒基因片段（BCRF-1）是EB病毒的重要開放編碼閱讀區(qū)，其能夠通過編碼VIL-10蛋白，進而導(dǎo)致鼻黏膜上皮細胞周期紊亂、加劇上皮細胞核DNA持續(xù)性異常擴增[4-5]。部分研究者探討了BCRF-1 mRNA在鼻咽癌患者中的表達情況，認為BCRF-1 mRNA表達的增加與鼻咽癌的早期發(fā)生密切相關(guān)[6]，但缺乏對于BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者自身免疫功能關(guān)系的研究。為了揭示BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從而為臨床上鼻咽癌的診療提供理論方面的參考，本研究探討了BCRF-1 mRNA的表達及其與鼻咽癌患者病情的關(guān)系，報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2018年5月長沙市第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的鼻咽癌患者54例（鼻咽癌組）作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理檢查確診;②患者及家屬知情同意;③鼻咽癌組患者病理診斷符合《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》[7]中關(guān)于鼻咽癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤;②既往有免疫系統(tǒng)疾病或近期服用過影響免疫系統(tǒng)的藥物;③研究前有放化療等抗腫瘤治療。選取我院同期就診的非腫瘤性鼻咽患者50例作為對照組。兩組受試者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1? ?兩組一般資料比較

1.2 分期標(biāo)準(zhǔn)

鼻咽癌的TNM分期按照中國鼻咽癌分期2017版與UICC/AJCC分期第8版標(biāo)準(zhǔn)[8]。T分期：Tx：原發(fā)腫瘤無法評估;T0：未發(fā)現(xiàn)腫瘤，但有EB病毒陽性且有頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié);T1：腫瘤局限于鼻咽，或侵犯口咽和/或鼻腔，無咽旁間隙受累;T2：腫瘤侵犯咽旁間隙和/或鄰近軟組織受累（翼內(nèi)肌、翼外肌、椎前肌）;T3：腫瘤侵犯顱底骨質(zhì)結(jié)構(gòu)、頸椎、翼狀結(jié)構(gòu)和/或鼻旁竇;T4：腫瘤侵犯至顱內(nèi)，有顱神經(jīng)、下咽、眼眶、腮腺受累和/或有超過翼外肌的外側(cè)緣的廣泛軟組織侵犯。其中T1期7例、T2期10例、T3期24例、T4期13例。N分期：Nx：無法評估區(qū)域淋巴結(jié);N0：無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;N1：單側(cè)頸部和/或咽后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（不論側(cè)數(shù)，最大徑≤6 cm，且位于環(huán)狀軟骨下緣以上區(qū)域）;N2：雙側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（最大徑≤6 cm，位于且環(huán)狀軟骨下緣以上區(qū)域）;N3：頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（不論側(cè)數(shù)，最大徑>6 cm和/或位于環(huán)狀軟骨下緣以下區(qū)域）。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR檢測BCRF-1 mRNA表達? 采集患者的外周靜脈血，加入0.2 mL的氯仿，2～8℃冰凍離心機中離心（12 000 r/min，離心15 min，半徑為10 cm），反復(fù)1次洗滌RNA，棄上清，在管底部可見乳白色沉淀物，加入1 mL 75%乙醇，0.1% DEPC水溶解。加入BCRF-1 mRNA和GAPDH的上下游引物、0.1% DEPC，使其終濃度均為20 pmol/μL，制備反應(yīng)體系。RT-PCR擴增的條件與參數(shù)：48℃ 45 min，94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 60 s，68℃ 2 min 共40個循環(huán);循環(huán)完畢后68℃延伸7 min。RT-PCR試劑盒購自寶生物技術(shù)有限公司（日本Takara）（批號：20110357）。BCRF-1基因引物上游5′-CAAGGACCAACTACAACC-3′，下游5′-TGCCTCTTCTTTAATTG-3′;內(nèi)參GADPH引物上游5′-GGTGAAGCTCGGAGTCAACG -3′，下游5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。結(jié)果按照2-ΔΔCt的方式進行表達。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞群? 采集患者清晨空腹血5 mL，置于肝素鈉抗凝管中，采用流式細胞儀雙標(biāo)法進行T淋巴細胞的檢測。相關(guān)標(biāo)記操作于5 mL抗凝管中進行，100 μL全血與CD4-FITC/CD8-PE抗體室溫反應(yīng)25 min，采用紅細胞裂解液Optilyse C溶血素溶解紅細胞，PBS液體洗滌3遍，每次5 min，生理鹽水重新懸浮細胞，上機檢測。（FACS calibur流式細胞儀購自美國BD公司，threg檢測試劑盒購自羅氏檢測公司，貨號：20120387，稀釋度：1∶500）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組和對照組BCRF-1 mRNA表達水平比較

鼻咽癌組BCRF-1 mRNA相對表達量為（0.895±0.103），明顯高于對照組（0.355±0.097），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 24.470，P < 0.05）。見圖1。

M：Marker;1：對照組;2：鼻咽癌組

圖1? ?鼻咽癌組與對照組BCRF-1 mRNA PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 鼻咽癌組織中BCRF-1 mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系分析

TNM分期T3～T4期、N2～N3期的鼻咽癌組織中BCRF-1 mRNA表達量明顯高于TNM分期T1～T2期、N0～N1期（均P < 0.05）。見表2。

2.3 鼻咽癌患者中BCRF-1 mRNA的相對表達量與T淋巴細胞亞群的關(guān)系分析

依據(jù)本研究中患者BCRF-1 mRNA平均相對表達量，將鼻咽癌患者分為BCRF-1 mRNA高表達組（表達量>0.895）和BCRF-1 mRNA低表達組（表達量 ≤0.895）。與BCRF-1 mRNA低表達組比較，BCRF-1 mRNA高表達組CD4+T細胞、CD4+/CD8+比例較低，而CD8+T細胞比例較高（均P < 0.05）。見表3。

表3? ?不同BCRF-1基因表達鼻咽癌患者T細胞亞群比較（x±s）

3 討論

在長期吸煙或者合并有相關(guān)家族史的患者中，鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險較高，特別是在合并有EB病毒感染的人群中，鼻咽癌的發(fā)生率可進一步上升[9]?，F(xiàn)階段臨床上通過手術(shù)或者放療措施治療鼻咽癌，其能夠提高鼻咽癌的治療水平，延長鼻咽癌患者的總體生存時間[10-12]。但長期的隨訪研究證實，鼻咽癌治療后生存轉(zhuǎn)歸的改善仍然不明顯，治療后鼻咽癌患者的病情惡化速度仍然較快。而本研究對鼻咽癌發(fā)展過程中基因因素的探討，有助于揭示鼻咽癌的發(fā)生機制，并為鼻咽癌患者的臨床診療提供理論前提。

臨床上鼻咽癌的發(fā)病機制仍不清楚，不同病理性因素的改變，均有提高鼻黏膜上皮細胞異常增殖的風(fēng)險，導(dǎo)致癌細胞轉(zhuǎn)錄水平的改變。EB病毒感染在促進鼻咽癌的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用，其能夠通過整合宿主細胞，增加鼻黏膜上皮細胞G1/S期的細胞比例，提高癌細胞的浸潤和黏附能力。而BCRF-1 mRNA作為EB病毒的非編碼開放閱讀區(qū)，其能夠通過分泌VIL-11蛋白，進而調(diào)控上皮細胞的增殖、凋亡及分化過程。相關(guān)的基礎(chǔ)研究也證實，BCRF-1 mRNA的表達能夠提高染色體DNA的擴增速度，并能夠通過甲基化或者磷酸化的修飾，降低癌細胞增殖過程中的基因錯配修復(fù)能力，促進癌基因的突變和癌細胞的擴增[13]。部分研究者探討了BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者生存預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BCRF-1 mRNA表達濃度的上升與鼻咽癌患者病死率或者總體生存時間密切相關(guān)[14]，但缺乏對于BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者T淋巴細胞亞群的關(guān)系研究。

本研究顯示，鼻咽癌組BCRF-1 mRNA的表達與對照組比較，濃度明顯上升，提示了BCRF-1 mRNA的高表達能夠參與鼻咽癌的病情過程。通過匯集不同的相關(guān)文獻，筆者認為這主要與BCRF-1 mRNA以下幾個方面的病理性作用有關(guān)[15-16]：①BCRF-1 mRNA的上升能夠通過提高鼻黏膜上皮細胞內(nèi)腫瘤信號通路的激活程度，激活A(yù)KT或者NF-κB，促進癌細胞的增殖;②BCRF-1 mRNA的上升能夠影響到鼻黏膜上皮細胞周期，導(dǎo)致癌細胞快速跨越G0期的能力明顯增加。楊璐等[17]研究者也認為，在鼻咽癌患者中，BCRF-1 mRNA的表達濃度可平均上升35%以上，特別是在中晚期鼻咽癌患者或者遠期生存時間較短的患者中，BCRF-1 mRNA的表達可進一步上升。本研究在探討相關(guān)因子與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系過程中，發(fā)現(xiàn)BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，TNM分期晚或者已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其BCRF-1 mRNA表達水平可明顯上升，這主要是由于BCRF-1 mRNA的表達能夠增加癌細胞浸潤能力，提高鼻黏膜上皮細胞浸潤深度，延長TNM分期;而BCRF-1 mRNA可以同時提高癌細胞對于鎖骨下或者頸部淋巴結(jié)的黏附能力，促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。但部分研究者并不認為BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[18-20]，這與本研究存在一定的差別，主要考慮與BCRF-1 mRNA的檢測靈敏度差別有關(guān)。最后本研究發(fā)現(xiàn)，BCRF-1 mRNA高表達組CD4+T淋巴細胞比例明顯下降，而CD8+T淋巴細胞明顯上升，提示BCRF-1 mRNA的表達與鼻咽癌患者的T淋巴細胞功能密切相關(guān)，這主要由于BCRF-1 mRNA能夠?qū)е伦陨砻庖咛右莸陌l(fā)生，并影響到樹突狀細胞的抗原提呈功能，進而導(dǎo)致T淋巴細胞亞群的改變[21-22]。

本研究的創(chuàng)新性在于探討了BCRF-1 mRNA的表達與T淋巴細胞亞群的關(guān)系。綜上所述，在鼻咽癌患者中，BCRF-1 mRNA的表達明顯上升，BCRF-1 mRNA的表達與患者TNM分期或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時BCRF-1 mRNA的表達還能夠影響到患者的T淋巴細胞功能。

[參考文獻]

[1]? 容敏華，李秋林，曹驥，等.2013年廣西腫瘤登記地區(qū)鼻咽癌發(fā)病和死亡分析[J].中國癌癥防治雜志，2017，9（2）：104-110.

[2]? Li J，Chen S，Peng S，et al. Prognostic nomogram for patients with Nasopharyngeal Carcinoma incorporating hematological biomarkers and clinical characteristics [J]. Int J Biol Sci，2018，14（5）：549-556.

[3]? Li A，Zhang Y，Zhang C，et al. Pathologic study of tumour extension for clinically localized unilateral nasopharyngeal carcinoma：Should the contralateral side be included in the clinical target volume？ [J]. J Med Imaging Radiat Oncol，2018，34（5）：90-93.

[4]? 鄒桂年，邱前輝，葉宇東，等.鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化基因的篩選[J].中山大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2016， 37（4）：530-534.

[5]? 任艷鑫，楊潔，孫瑞梅，等.vIL-10對鼻咽癌細胞株MCH-1類分子抗原加工提呈“操縱子”表達的影響[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，37（4）：525-530.

[6]? 趙新星，張龍城，全超坤，等.EB病毒BRLF1基因及EB病毒Rta/IgG抗體在鼻咽癌中表達的臨床意義[J].中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16（4）：243-247.

[7]? 中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1991.

[8]? 中國鼻咽癌TNM分期工作委員會.中國鼻咽癌分期2017版（2008鼻咽癌分期修訂專家共識）[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志，2017，26（10）：1119-1125.

[9]? 楊志勇，黃晶.不同分期鼻咽癌治療模式探討[J].癌癥進展，2017，15（1）：108-113.

[10]? Qu Y，Wang D，Yang L，et al. Expression and clinical significance of programmed death ligand 1 in nasopharyngeal carcinoma [J]. Molecular and Clin Oncol，2018， 34（5）：90-94.

[11]? Li L，Li Y，Zhang J，et al. Optimization of cervical lymph node clinical target volume delineation in nasopharyngeal carcinoma：a single center experience and recommendation [J]. Oncotarget，2018，9（43）：45-47.

[12]? 鄭小雅，劉同欣，王方正，等.微信公眾平臺對鼻咽癌放療患者治療及護理依從性的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2017， 55（2）：56-160.

[13]? 楊穎，沈智超，劉芡芡，等.EB病毒編碼基因BARF1對鼻咽癌細胞增殖和遷移影響[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，51（3）：261-263.

[14]? 秦鈾，胡彥，楊辰蘇，等.鼻咽癌血清生物標(biāo)志物研究新進展[J].中國癌癥防治雜志，2017，9（4）：272-276.

[15]? 高亞娜，陳濤.系統(tǒng)評估多個基因多態(tài)性位點與鼻咽癌易感性關(guān)聯(lián)的Meta分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2016，10（23）：3583-3587.

[16]? 徐唐鵬，王琪，宋啟斌.基因多態(tài)性與個體鼻咽癌易感性[J].武漢大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，36（6）：1005-1010.

[17]? 楊璐，王德輝.EB病毒引起的表觀遺傳學(xué)改變在鼻咽癌中的作用[J].中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15（2）：138-140.

[18]? 王偉娜，高翔翔，沈智超，等.鼻咽癌和健康人群中EB病毒BARF0基因序列分析[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（4）：383-385.

[19]? Xu T，Su B，Huang P，et al. Novel biomarkers of nasopharyngeal carcinoma metastasis risk identified by reverse phase protein array based tumor profiling with consideration of plasma Epstein-Barr virus DNA load [J]. Proteomics Clin Appl，2017，11（5/6）.

[20]? Zhang J，Shi H，Jiang T，et al. Circulating tumor cells with karyotyping as a novel biomarker for diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma [J]. BMC Cancer，2018，18（1）：45-47.

[21]? Ouyang F，Guo B，Zhang B，et al. Exploration and validation of radiomics signature as an independent prognostic biomarker in stage Ⅲ-Ⅳb nasopharyngeal carcinoma [J]. Oncotarget，2017，8（43）：103-105.

[22]? Gong D，Li Z，Ding R，et al. Extensive serum biomarker analysis in patients with nasopharyngeal carcinoma [J]. Cytokine，2018，34（7）：90-93.

（收稿日期：2018-12-18? 本文編輯：張瑜杰）