microRNA在皮膚黑色素瘤血清與毛發(fā)中的差異表達(dá)

林千里 張文俊 王中志 汪匯 江華

[摘要] 目的 探討皮膚惡性黑色素瘤miRNA的差異表達(dá)有望為該腫瘤的診斷和靶向治療提供依據(jù)，篩選皮膚惡性黑色素瘤血清和毛發(fā)2個(gè)部位的7個(gè)特異性miRNA表達(dá)差異。 方法 收集2016年3月～2017年10月在海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院手術(shù)局部切除并經(jīng)常規(guī)組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)為惡性皮膚黑色素瘤（CM）的12個(gè)病例作為CM組，同期收集非腫瘤疾病的17個(gè)皮膚病病例作為對(duì)照組。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩組患者的血清和毛發(fā)中miRNA表達(dá)情況。將檢測(cè)結(jié)果一致的候選miRNA確定為有意義的共同差異表達(dá)生物學(xué)指標(biāo)，利用組間差異倍數(shù)篩選出差異>2.5倍差異表達(dá)的miRNA。 結(jié)果 CM組患者血清中7個(gè)miRNA有2個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào)，上調(diào)的miRNA包括miR-4487和miR-4706，下調(diào)的miRNA包括miR-16、miR-211、miR-4731、miR-509-3p和miR-514a;毛發(fā)中有3個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)，上調(diào)的miRNA包括miR-211、miR-4487和miR-4731;下調(diào)的miRNA包括miR-16、miR-4706、miR-509-3p和miR-514a。與對(duì)照組比較，CM組miR-4487在血清和毛發(fā)中共同上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與對(duì)照組比較，CM組血清和毛發(fā)中has-miR-16和has-miR-509-3p表達(dá)顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），并且一致性較高;與對(duì)照組比較，CM組血清和毛發(fā)中miR-541a表達(dá)雖然顯示共同下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。血清和毛發(fā)差異表達(dá)2.5倍以上的miRNA為miR-16和miR-514a;單獨(dú)毛發(fā)差異表達(dá)2.5倍以上的miRNA為miR-4706;單獨(dú)血清標(biāo)本4倍以上差異表達(dá)為miR-4731;血清標(biāo)本10倍以上差異表達(dá)的miRNA為miR-211和miR-509-3p。 結(jié)論 與非腫瘤疾病患者比較，血清和毛發(fā)中存在多種miRNA的差異表達(dá)，CM患者血清中miR-211和miR-509-3p存在高度顯著差異表達(dá)，可以作為該腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物;毛發(fā)標(biāo)本miR-4706的差異表達(dá)有可能成為黑色素瘤早期非創(chuàng)傷性檢測(cè)的生物學(xué)指標(biāo)。miRNA檢測(cè)對(duì)CM是可利用的生物學(xué)指標(biāo)，也可能成為今后靶基因治療的手段。

[關(guān)鍵詞] 皮膚黑色素瘤;微小RNA;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;差異表達(dá)

[中圖分類號(hào)] R739.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）09（b）-0007-06

Differential expression of microRNAs in serum and hairs different position of cutaneous melanoma

LIN Qianli? ?ZHANG Wenjun? ?WANG Zhongzhi? ?WANG Hui? ?JIANG Hua

Department of Plastic Surgery， Shanghai Changzheng Hospital， Navy Military Medical University， Shanghai? ?200003， China

[Abstract] Objective To investigate the differential expression of microRNAs in cutaneous malignance melanoma in order to provide a basis for the diagnosis and targeted treatment of this malignancy; to screen seven specific microRNAs in serum and hairs of cutaneous malignancy melanoma. Methods From March 2016 to October 2017， 12 cases of cutaneous melanoma （CM）? confirmed by routine histopathology and immunohistochemistry in Shanghai Changzheng Hospital， Navy Military Medical University， were collected as CM group， while 17 cases of non-neoplastic skin diseases were collected as control group. The expression situation of microRNAs in serum and hair of two groups were detected by qRT-PCR. Candidate microRNAs with consistent results were identified as significant common differential expression biological indicators. The differentially expressed microRNAs （> 2.5 times） were screened by the multiple of differences between groups. Results There were 2 up-regulated and 5 down-regulated microRNAs in serum among 7 microRNAs of patients in CM group. The up-regulated microRNAs included miR-4487 and miR-4706， the down-regulated microRNAs included miR-16， miR-211， miR-4731， miR-509-3p and miR-514a. There were 3 up-regulated and 4 down-regulated microRNAs in hairs， the up-regulated microRNAs included miR-211， miR-4487 and miR-4731; the down-regulated microRNAs included miR-16， miR-4706， miR-509-3p and miR-514a. The co-up-regulated microRNAs in serum and hairs of the CM group were microRNAs-4487， but there was no statistically significant difference between the two groups （P > 0.05）. Compared with the control group， the expressions of has-microRNA-16 and has-microRNA-509-3p were significantly down-regulated， the differences were statistically significant （P < 0.05）， and with high consistency. Compared with control group， the expression of miRNA-541a in serum and hairs of CM group was down-regulated， but there was no statistically significant difference （P > 0.05）. MiRNAs with more than 2.5 times differential expression in serum and hairs were miR-16 and miR-514a. In hair alone， miR-4706 was with differential expression of more than 2.5 times. The miR-4731 was more than 4 times differentially expressed in serum samples alone. MiRNAs with more than 10 times differential expression in serum were miR-211 and miR-509-3p. Conclusion Compared with non-cancer patients， there are many differentially expressed microRNAs in serum and hairs. There are highly significant differentially expressed microRNAs 211 and 509-3p in serum of CM patients， which can be used as biological markers of the tumor. Differential expression of microRNAs 4706 in hair samples may be the biology of early noninvasive detection of melanoma. Indicators. Detection of microRNAs is an available biological indicator for CM， and may become a means of target gene therapy in the future.

[Key words] Cutaneous melanoma; MicroRNA; Signal transduction pathway; Differential expression

惡性黑色素瘤是最具侵襲性和轉(zhuǎn)移性的腫瘤，雖然在各種皮膚惡性腫瘤發(fā)病中僅占4%，但易轉(zhuǎn)移，已成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的癌癥，死亡率高達(dá)70%左右[1]，轉(zhuǎn)移性黑素瘤（CM）患者的5年生存率不足15%[2]。皮膚黑素瘤中存在異常表達(dá)的微小核糖核酸（microRNA，miRNA），而且與該疾病病情演進(jìn)和轉(zhuǎn)移等惡性程度的研究報(bào)道日益增多[3-5]。miRNA是一類長(zhǎng)度為20～24 nt的非編碼單鏈小RNA，約占整個(gè)基因組的1%，有研究[6-7]認(rèn)為人類基因組中約1/3受miRNA調(diào)控。miRNA參與了人類大多數(shù)腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展，其作用類似抑癌基因或癌基因，目前相關(guān)研究主要集中于乳腺癌、肺腫瘤、肝癌、前列腺癌和白血病等。本研究運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)血清和毛發(fā)不同部位CM miRNA表達(dá)，以便進(jìn)一步研究CM在早期診斷上的意義以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年3月～2017年10月在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）手術(shù)局部切除并經(jīng)常規(guī)組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)為皮膚惡性黑色素瘤（cutaneous malignance melanoma，CMM）的12例患者，并設(shè)為CM組;選擇同期我院收集17個(gè)非腫瘤皮膚病病例作為對(duì)照組。12例CM組患者中，男7例，女5例;年齡29～81歲，平均（54.3±13.3）歲。臨床皮損表現(xiàn)為黑斑、結(jié)節(jié)、腫塊和潰瘍等，分布于肢端7例，腹壁5例。其中1例已發(fā)生局部淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移。術(shù)后分別經(jīng)2名及以上病理醫(yī)師單獨(dú)診斷。所有患者術(shù)前均未接受任何治療。17例對(duì)照組患者均經(jīng)病理確診排除黑色素瘤樣病變，其中男12例，女5例;年齡19～73歲，平均（52.5±10.4）歲。兩組病例年齡和性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均在術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本采集

1.2.1 血液樣本? 采集受試者靜脈全血，置于5 mL血清采集管中，室溫靜置1 h后離心（2700×g，10 min），冰浴上小心吸取上層血清至EP管中，標(biāo)記后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 毛發(fā)樣本? 留取受試者枕部毛發(fā)發(fā)梢，每例受試者留取10根，長(zhǎng)度為1 cm，用70%乙醇5 mL浸泡1 h，加若干蒸餾水洗凈，加入5 mL 4℃ 0.9%NaCl溶液置粉碎機(jī)中充分粉碎10 min，收集后置EP管中，隨后加入5% β-巰基乙醇1 mL和20 μL蛋白酶K（20 mg/μL），置37℃孵育箱10～12 h，再加入2 mL氯仿，經(jīng)離心（4700×g，3 min），置1.5 mL EP管，標(biāo)記后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

mirVanaTM miRNA提取試劑盒、mirVanaTM miRNA標(biāo)記試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，Applied Biosystems 7300熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司。1.5 mL無(wú)核酸酶離心管（美國(guó)Axygen公司）;磁力攪拌棒、磁力攪拌盤(pán)（美國(guó)Corning公司）;微型離心器（美國(guó)ThermoFisher公司）;染色盤(pán)和滑架（×3）（英國(guó)ThermoShandon公司）;NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.4 方法

1.4.1 提取miRNA? 依照說(shuō)明書(shū)提取血清和毛發(fā)組織中的總RNA（富集miRNA）。提取總RNA每個(gè)標(biāo)本用1 mL Trizol試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解，將上述裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，室溫下靜置5 min;每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿后振蕩15 s，室溫靜置2～3 min，2～8℃條件下12000×g離心15 min;收集上層水相置于新EP管中，每1 mL Trizol中加0.5 mL異丙醇，室溫下靜置10 min，12000×g離心10 min;棄上清液，每1 mL Trizol加1 mL 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500×g離心5 min，棄上清;讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥。無(wú)核酶水中溶解RNA沉淀，采用ND-1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)為260、280和230 nm處所抽提的總RNA中的吸光度（A）值，確定樣品濃度和總量。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.4.2 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測(cè)定miRNA? ①逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：取總RNA 1 μg，miScript逆轉(zhuǎn)錄酶混合液1 μL，5×miScript RT緩沖液4 μL，加無(wú)RNA酶水至反應(yīng)體積為20 μL。37℃溫浴60 min，95℃ 5 min，終止反應(yīng)。②熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)差異表達(dá)基因：cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，探針目標(biāo)序列見(jiàn)表1。cDNA模板2 μL，加無(wú)RNA酶水定容至總反應(yīng)體積50 μL。反應(yīng)條件：初始活化95℃ 15 min;變性94℃ 15 s，退火55℃ 30 s，延伸70℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。相同條件下實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。miRNA測(cè)定選取U6 snRNA作為內(nèi)參;相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt值表達(dá)。2-ΔΔCt值以>2.5倍為顯著性差異，即兩組樣本miRNA表達(dá)差異倍數(shù)>2.5倍。

表1? ?定量PCR探針目標(biāo)序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GeneSpringGX基因分析統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清和毛發(fā)2種不同來(lái)源的miRNA qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，CM組患者血清中上調(diào)的miRNA為miR-4487和miR-4706，下調(diào)的miRNA為miR-16、miR-211、miR-4731、miR-509-3p和miR-514a;CM組患者毛發(fā)中上調(diào)的miRNA為miR-211、miR-4487和miR-4731，下調(diào)的miRNA為miR-16、miR-4706、miR-509-3p和miR-514a;在2種不同類型取材中共同上調(diào)的miRNA為miR-4487，共同下調(diào)的miRNA為miR-16、miR-509-3p和miR-514a。見(jiàn)表2。

2種不同來(lái)源的miRNA RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CM組患者血清及毛發(fā)中has-miR-4478在血清和毛發(fā)中共同上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;兩組miR-4706的表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;CM組血清has- miR-4731表達(dá)低于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而毛發(fā)has- miR-4731表達(dá)高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;與對(duì)照組比較，CM組血清和毛發(fā)中has-miR-16和has-miR-509-3p的表達(dá)均下調(diào)，但僅血清中has-miR-16差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;而CM組血清和毛發(fā)中miR-514a表達(dá)雖然顯示共同下調(diào)，但與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。血清和毛發(fā)中has-miR-211的表達(dá)相反，CM組血清中miR-211較對(duì)照組顯著下調(diào)，而毛發(fā)中has-miR-211的表達(dá)卻較對(duì)照組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 CM患者血清與毛發(fā)組織中miRNA表達(dá)譜的差異表達(dá)

將12例CM患者血清分別與毛發(fā)組織相對(duì)應(yīng)的miRNA表達(dá)進(jìn)行比較，2.5倍以上差異表達(dá)miRNA為miR-16（血清中表達(dá)降低3.23倍和毛發(fā)中表達(dá)降低3.12倍）、miR-4706（僅毛發(fā)中表達(dá)降低3.03倍） 和miR-514a（血清和毛發(fā)均存在表達(dá)差異性降低，分別降低2.67、2.66倍）;4倍以上差異表達(dá)僅為miR-4731（僅血清差異性表達(dá)降低8.76倍）;10倍以上差異表達(dá)分別為血清miR-211和miR-509-3p（分別降低11.92、12.34倍）。見(jiàn)表3、圖1。

表3? ?CM患者血清和頭發(fā)中miRNA檢測(cè)結(jié)果（ΔΔCt值和2-ΔΔCt值）

注：miRNA 2-ΔΔCt值=2-（ΔCt對(duì)照組miRNA檢測(cè)值-ΔCt CM組miRNA檢測(cè)值），即對(duì)照組與CM組miRNA表達(dá)差異倍數(shù)

以對(duì)照組血清和毛發(fā)miRNA檢測(cè)值為1

圖1? ?黑色素瘤患者血清和頭發(fā)中miRNA檢測(cè)差異表達(dá)倍數(shù)（2-ΔΔCt值）

3 討論

miRNA是一種內(nèi)源性、非編碼蛋白質(zhì)的短小序列RNA。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)miRNA相應(yīng)的DNA基因拷貝數(shù)與轉(zhuǎn)錄水平的miRNA一致，它可導(dǎo)致miRNA下調(diào)。黑素瘤中有85.9%的DNA基因變異相關(guān)miRNA表達(dá)異常。既往黑色素瘤的研究多基于基因或蛋白水平，近十年來(lái)眾多研究表明，表達(dá)異常的miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。miRNA調(diào)節(jié)了人類1/3的編碼基因，因此找出與黑色素瘤發(fā)生和增殖相關(guān)的關(guān)鍵miRNA，并研究這些miRNA與其靶基因的調(diào)控關(guān)系，可為黑色素瘤早期診斷以及治療的研究奠定基礎(chǔ)[9]。PCR檢測(cè)技術(shù)因精確精準(zhǔn)且價(jià)廉，大大加快了其在腫瘤miRNA診斷方面的應(yīng)用。

目前臨床上缺乏有效的黑色素瘤早期診斷指標(biāo)。大部分黑色素瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期并已發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此黑色素瘤的早期診斷有極其重要的意義，而miRNA異常表達(dá)的檢測(cè)可為黑色素瘤早期診斷提供可能。2012年，Xu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與色素痣比較，miR-203和miR-205在黑色素瘤中明顯下調(diào)，可作為黑色素瘤早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。Babapoor等[11]前期研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤組織中miRNA-211顯著低表達(dá)。該研究進(jìn)一步對(duì)石蠟包埋黑色素瘤和色素痣組織中進(jìn)行miR-211原位雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示黑色素瘤中miR-211表達(dá)水平明顯低于色素痣，其作為黑色素瘤早期診斷指標(biāo)的敏感性和特異性分別為90%和86.2%。

本研究運(yùn)用7條成熟miRNA在人皮膚黑素瘤組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在共同高度差異表達(dá)（>4倍）的miRNA為miR-211、miR-509-3p、miR-4731。miR-211在黑色素瘤中的表達(dá)水平明顯下調(diào)，是該腫瘤的早期輔助診斷指標(biāo)[12]。本研究中用RT-PCR方法篩選出miRNA與非黑色素瘤患者組織中存在的差異表達(dá)，這些差異表達(dá)高度下調(diào)的miR-211與既往發(fā)表的研究結(jié)果相同[13-14];同時(shí)對(duì)于編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（BRAF）V600突變陽(yáng)性和不能手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移性的黑素瘤，采用維羅非尼（Vemurafenib）個(gè)體化靶向治療，可觀察到miR-211顯著升高[13]。同樣，本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)皮膚黑素瘤患者血清miR-509-3p顯著下調(diào)（達(dá)12.34倍）。有研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖6（Glypicans 6）通過(guò)對(duì)Wnt、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）和骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）等信號(hào)通路導(dǎo)致皮膚黑素瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而這一過(guò)程可以被miR-509-3p所抑制，反之也說(shuō)明血清miR-509-3p顯著下調(diào)是皮膚黑素瘤進(jìn)展的重要標(biāo)志物[14]。但這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與丹麥的研究不同，可能與他們所關(guān)注的眼結(jié)膜黑色素瘤的腫瘤種類不同有關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)皮膚黑素瘤患者血清miR-4731顯著下調(diào)（達(dá)8.76倍），Stark等[16]基礎(chǔ)研究證明，miR-4731與細(xì)胞周期通路和黑色素瘤發(fā)生高度相關(guān)，miR-4731過(guò)表達(dá)可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期通路中的CCNA2、ORC5L和PCNA;同時(shí)可調(diào)節(jié)黑色素瘤相關(guān)基因RAB7A、CTSD和GNA13的表達(dá)，總之，miR-4731表達(dá)降低是黑色素瘤的危險(xiǎn)因素。

用血清和毛發(fā)不同部位黑色素瘤患者標(biāo)本差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)到的靶基因參與的信號(hào)通路不盡相同，僅miR-16和miR-514a共同低表達(dá)于血清和毛發(fā)，已有報(bào)道，miR-16表達(dá)有助于抑制CM腫瘤細(xì)胞的增殖[17];目前關(guān)于miR-514a對(duì)黑色素瘤的作用尚不明確，但有研究報(bào)道，miR-514a通過(guò)EGFR/MAPK/ERK信號(hào)通路，對(duì)腎臟腫瘤是一個(gè)新的抑制劑[18]。而miR-4706獨(dú)特表現(xiàn)于頭發(fā)標(biāo)本，可能與黑色素瘤患者不同部位黑色素形成和功能有關(guān)，這也可能是黑色素瘤診斷以及今后設(shè)計(jì)藥物的靶點(diǎn)。經(jīng)檢索PubMed、Medline、miRBase22.0、國(guó)內(nèi)萬(wàn)方和中國(guó)知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)均未發(fā)現(xiàn)有miR-4706的相關(guān)研究報(bào)道，于miRBase22.0數(shù)據(jù)庫(kù)中可以了解miR-4706主要來(lái)源于黑色素瘤、成黑素細(xì)胞（melanoblast）和視網(wǎng)膜黑色素瘤（uveal melanoma）。差異表達(dá)研究中，突出表現(xiàn)在組織來(lái)源不同所呈現(xiàn)出相反的結(jié)果，如：CM患者血清miR-211和miR-4731檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)為顯著下降（ΔΔCt值分別為-3.58和-3.32），而毛發(fā)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均為增高（ΔΔCt值分別為0.80和0.82），因此對(duì)于miRNA檢測(cè)分析中必需加入條件設(shè)定，如本研究設(shè)定2-ΔΔCt值以>2.5倍為顯著性差異，而對(duì)照組均設(shè)定為1倍。一般而言，低于2.5倍的DNA或RNA檢測(cè)值（2-ΔΔCt值）可被認(rèn)定為無(wú)顯著性差異。在2-ΔΔCt 計(jì)算值表達(dá)上，與對(duì)照組比較，本研究觀察到CM患者血清miR-211顯著降低11.92倍，而毛發(fā)部位miR-211表達(dá)增高1.70倍;同樣，CM患者血清miR-4731顯著低表達(dá)，為8.76倍，而毛發(fā)中的表達(dá)略增高0.59倍。即miR-211和miR-4731在毛發(fā)中的表達(dá)基本等同于對(duì)照組，可認(rèn)定為這2個(gè)miRNA在毛發(fā)中不能靈敏檢測(cè)CM病變。

本研究存在的不足之處在于：①收集的標(biāo)本量不足，容易造成生物信息學(xué)分析的遺漏和數(shù)據(jù)偏移。②本研究中采用的研究方法較簡(jiǎn)單，采用倍數(shù)分析對(duì)基因表達(dá)情況進(jìn)行簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)學(xué)推斷方法可比性稍差。③本研究中對(duì)研究結(jié)果未采用熒光素酶報(bào)告基因（Luciferase）和Western blot法的驗(yàn)證，也未進(jìn)行體外黑色素瘤細(xì)胞株結(jié)合體內(nèi)研究進(jìn)行驗(yàn)證。④由于實(shí)驗(yàn)所有的CM標(biāo)本均來(lái)自近2年內(nèi)的手術(shù)患者，患者的預(yù)后隨訪以及生存率還無(wú)法進(jìn)行評(píng)估。有待進(jìn)一步深入研究，為黑色素瘤的早期診斷、治療和預(yù)后研究提供新的策略。

4 結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)對(duì)12例黑色素瘤和17例非黑色素瘤皮膚病血清和頭發(fā)組織miRNA表達(dá)水平進(jìn)行了比較，初步取得了CM有差異性表達(dá)的miRNA結(jié)果。CM患者血清標(biāo)本顯示miR-211和miR-509-3p與非腫瘤患者具有10倍以上的差異，是黑色素瘤顯著的生物學(xué)標(biāo)志物;而CM患者毛發(fā)標(biāo)本miR-4706特異性的下調(diào)可能是診斷黑色素瘤早期非創(chuàng)傷性檢查生物學(xué)標(biāo)志物。

應(yīng)用小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）技術(shù)治療黑色素瘤已成為一種新型治療途徑，有研究者探索將siRNA用于治療，但有效性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證[19]。由于RNA干擾技術(shù)的迅猛發(fā)展及臨床實(shí)踐的有效性，相信miRNA作為生物標(biāo)志物極有可能成為未來(lái)治療惡性黑色素瘤的治療靶點(diǎn)。未來(lái)在增加例數(shù)和對(duì)各型黑色素瘤分析基礎(chǔ)上，更深入地研究，探討其發(fā)病機(jī)制及基因治療的思路。miRNA的研究也符合最新美國(guó)皮膚病學(xué)學(xué)會(huì)2019黑色素瘤指南的要求，可以為臨床早期輔助診斷、治療以及預(yù)后判斷提供更有效的手段[20]。

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（收稿日期：2019-06-05? 本文編輯：任? ?念）