宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞中HIF-1α、survivin的表達及其與放射敏感性的關系

古力米熱·布然江，阿衣西布衛(wèi)·庫爾班，李小文

新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科腫瘤放療科，烏魯木齊830011

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，且病理類型多為鱗狀細胞癌，發(fā)病早期缺乏典型性臨床癥狀，導致多數患者確診時已是中晚期，喪失了最佳診療時機[1]。臨床研究表明，乏氧細胞的存在不僅是腫瘤放療敏感性下降的重要原因之一，同時與腫瘤細胞的發(fā)生、侵襲、轉移密切相關，細胞凋亡被抑制時，異常細胞分裂增殖，導致腫瘤的發(fā)生，故乏氧細胞的存在和凋亡過程受抑制是導致腫瘤難治愈、易復發(fā)、易轉移的重要因素之一[2]。在乏氧條件下，低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可以與細胞核內出現(xiàn)乏氧反應的元件結合，增強HIF-1α表達水平，可促進腫瘤血管生成、增強腫瘤細胞侵襲能力、增強腫瘤對放化療抵抗[3]。存活蛋白（survivin）是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的成員。survivin在分化成熟的組織中不表達或低表達，在胚胎組織中表達，而在大多數腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后密切相關[4]。survivin可以抑制細胞凋亡，同時調節(jié)細胞增殖，并與腫瘤細胞放療或化療敏感性有關，有望成為宮頸癌新的治療靶點[5]。本研究以宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞[6]作為研究對象，探討在乏氧條件下，HIF-1α和survivin在宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞中的表達，及兩種基因沉默后與宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞的放射敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞株購自中國科學院上海細胞所，穩(wěn)定轉染HIF-1α小干擾RNA（small inteferirng RNA，siRNA）的干擾細胞由實驗室構建保存。羊抗兔二抗購自精美（北京）科技有限公司，辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠二抗購自Rockland公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜均購自上海羅氏制藥公司；化學發(fā)光試劑盒購自Pierce公司。轉染試劑選擇ON-TARGETplusHIF-1αsiRNA、ON-TARGETplussurvivinsiRNA，陰性對照選擇ON-TARGETplus Non-targeting Pool，轉染指示劑選擇DharmaFECT 1 Transfection Reagent，均購自上海帛龍生物科技有限公司。蛋白提取選用凱基蛋白提取試劑盒，購自美國SONICS公司。反轉錄試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞的培養(yǎng)及乏氧狀態(tài)建立

宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放在孵育箱中以5%CO2、37℃培養(yǎng)，每1～2天換一次培養(yǎng)基。在細胞布滿70%～80%瓶底時以0.25%胰蛋白酶消化傳代。細胞狀態(tài)穩(wěn)定后使用二氯化鈷模擬細胞缺氧環(huán)境，二氯化鈷濃度選取200 μmol/L，細胞密度1×106/L，乏氧培育24 h后使用CCK-8法檢測吸光度值，在96孔板邊緣一圈培養(yǎng)箱中加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）100 μl作為陰性對照，評估細胞活性。

1.3 蛋白表達情況檢測

采用蛋白質印跡法（Western blot）對在二氯化鈷模擬乏氧環(huán)境下培養(yǎng)的細胞株（陽性對照組）和未進行乏氧培養(yǎng)的細胞株（空白對照組）進行HIF-1α和survivin檢測，蛋白提取選用凱基蛋白提取試劑盒，蛋白測定選用凱基蛋白測定試劑盒，HIF-1α抗體濃度為1∶1000，survivin抗體濃度為1∶5000，內參選用anti-β-actin ab8227，抗體濃度為1∶1000。按照常規(guī)Western blot電泳后記錄電泳圖像。

1.4 基因沉默細胞株的建立及鑒定

1.4.1 siRNA轉染細胞株本研究采用靶向HIF-1α和survivin的siRNA真核表達載體，轉染宮頸鱗狀細胞癌SiHa細胞株，下調基因表達。轉染siRNA 48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，并收集細胞，細胞數量為3×106個。鏡下觀察可確定siRNA轉染是否有效?？瞻讓φ战M：未進行乏氧培養(yǎng)的SiHa細胞；陰性對照組：乏氧培養(yǎng)后未進行轉染的SiHa細胞；HIF-1αsiRNA組：乏氧培養(yǎng)后進行HIF-1αsiRNA轉染的SiHa細胞；survivinsiRNA組：乏氧培養(yǎng)后進行survivinsiRNA轉染的SiHa細胞。

1.4.2 反轉錄聚合酶鏈反應檢測基因表達情況將siRNA轉染后的SiHa細胞，在轉染48 h后，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，采用反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測HIF-1α、survivin基因表達情況。為防止RNA降解，反轉錄后的cDNA在-20℃保存。采用反轉錄試劑盒進行反轉錄，反轉錄體系：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，總RNA最大量 500 ng，RNase free DH2O 10 μl；反轉錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃保持。根據GeneBank查詢基因序列號，設計基因引物序列。HIF-1α反義：5'-TGCAACATGGAAGGTATTGC-3'，HIF-1α正義 ：5'-GGTTCACAAATCAGCACCAA-3'；survivin反義：5'-CCCTGCCTGGCAGCCCTTTC-3'，survivin正義：5'-CTGGCTCCCAGCCTTCCA-3'。

RT-PCR反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）12.5 μl，PCR Forward Primer 10 μmol/L 1.0 μl，PCR Reverse Primer 10 μmol/L 1.0 μl，RT 反應液（cDNA）2 μl，DH2O 8.5 μl，總量 25 μl。RTPCR 條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃30 s，72℃1 min，連續(xù)進行70個循環(huán)；72℃10 min。

1.5 細胞放射后狀態(tài)變化及放射敏感性檢測

采用經上述方法培養(yǎng)后的基因沉默細胞株進行照射。照射方法：直線加速器VARIAN，機架角度180°，6-MV射線，劑量率200 cGy/min，照射野10cm×10cm，垂直源皮距100cm，室溫下照射。照射時選擇厚度為2cm的有機玻璃板在細胞培養(yǎng)板下，在每組相同劑量點進行同野同時照射，對劑量點進行單次照射。分別對每組細胞進行照射，照射劑量根據實驗設定為0、2、4 Gy 3組。

1.5.1 HE染色觀察細胞形態(tài)按照預先設定的實驗分組進行照射，照射后將細胞放回37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后進行HE染色。

1.5.2 細胞克隆形成實驗檢測放射敏感性細胞克隆形成率是指接種細胞后貼壁的細胞成活以及形成的克隆數量，可以表示細胞群體的依賴性、增殖能力。本實驗采用放射增敏比（sensitivity enhanced ratio，SER）、集落形成率（plating efficiency，PE）、細胞的存活分數（survival fraction，SF）描述放射敏感性相關指標。SF=實驗組集落形成數/陰性對照組集落形成數×100%。PE=形成集落數/細胞接種數×100%。SER=空白對照組SF/陰性對照組或基因處理組SF。分別對每組細胞進行檢測，并檢測0、2、4 Gy劑量照射后的情況。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計數資料以例數表示，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Westernblot法檢測乏氧培養(yǎng)前后SiHa細胞中HIF-1 α、survivin表達情況

Western blot法檢測乏氧培養(yǎng)后SiHa細胞中HIF-1α和survivin蛋白表達均升高，其中HIF-1α在未乏氧時明顯低表達，乏氧后表達明顯升高。（圖1）

圖1 Western blot法檢測乏氧培養(yǎng)前和乏氧培養(yǎng)24h后HIF-1 α及survivin的表達情況

2.2 RT-PCR檢測轉染效果

在乏氧狀態(tài)下，陰性對照組HIF-1α的相對表達量為（6.68±1.32），高于HIF-1αsiRNA 組的（0.58±0.13），差異有統(tǒng)計學意義（t=5.144，P＜0.05）；陰性對照組survivin相對表達量為（1.16±0.03），高于survivinsiRNA組的（0.10±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（t=2.144，P＜0.05）。

2.3 放射后細胞形態(tài)變化及放射敏感性比較

2.3.1 細胞形態(tài)觀察HE染色結果顯示，HIF-1αsiRNA組、survivinsiRNA組細胞放療后形態(tài)發(fā)生明顯改變。2 Gy劑量照射后細胞出現(xiàn)明顯水腫樣改變，即細胞體積明顯增大，部分透明淡染呈氣球樣改變，少部分細胞出現(xiàn)脂肪樣變性，即出現(xiàn)脂滴，HE染色可見空泡狀；4 Gy劑量照射后細胞出現(xiàn)明顯脂肪樣變性，部分細胞出現(xiàn)核濃縮改變，細胞間隙可見點狀紅染提示發(fā)生纖維素樣變性。而陰性對照組細胞在2 Gy和4 Gy劑量照射后細胞形態(tài)變化均不明顯，僅部分細胞出現(xiàn)包漿淡染現(xiàn)象。（圖 2）

圖2 不同劑量照射后各組細胞的形態(tài)觀察（HE染色，×400）

2.3.2 細胞克隆形成實驗檢測PE、SF、SER 各組細胞隨著照射劑量增加，PF、SF、SER值均下降。在放射劑量為2 Gy和4 Gy時，HIF-1αsiRNA組與survivinsiRNA組的SER均高于空白對照組和陰性對照組。（表1）

表1 4組細胞在不同劑量照射下的PF、SF、SER值

3 討論

宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤，而由于醫(yī)療條件限制，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已是局部晚期，喪失手術機會，而放療是中晚期宮頸癌最主要的治療手段。但放療后腫瘤消退及局部控制率明顯不同，主要原因在于腫瘤放射敏感性存在很大的個體差異。隨著研究的不斷深入及研究方法的不斷發(fā)展，從最初的大體組織細胞水平到目前的分子基因水平，人們認識到放射敏感性差異與細胞乏氧、細胞周期、增殖活性、DNA損傷修復和細胞凋亡等密切相關。

HIF-1能夠激活多種低氧反應性基因的表達，由α、β兩個亞基組成，HIF-1α為氧調節(jié)性蛋白。而乏氧條件下腫瘤細胞的放療抵抗和細胞增殖與凋亡、損傷修復、周期分布等有很大的相關性。HIF-1α與腫瘤細胞放射治療的敏感性也存在一定的聯(lián)系，在氧含量的敏感性反應研究中是利用HIF-1α亞基完成的，它對細胞的損傷修復、腫瘤侵襲轉移、增殖與凋亡、血管形成、細胞周期分布、能量代謝等方面也有影響[7]。survivin為凋亡抑制基因，只在腫瘤和胚胎組織中表達，具有顯著的腫瘤特異性，與腫瘤細胞的浸潤轉移、分化增殖有著很大的關系，在G2/M期高表達，在G1期低表達，與腫瘤凋亡密切相關[8]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術是研究基因功能中非常重要的工具[9-11]。其主要原理：在哺乳動物細胞中體外導入siRNA模擬雙鏈RNA的體內切割產物，使雙鏈RNA發(fā)生特異性的降解，導致相應的基因沉默。本研究即采用siRNA轉染方式，轉染后基因沉默明顯，可持續(xù)性傳代。

在本研究中，未乏氧狀態(tài)下HIF-1α及survivin處于低表達狀態(tài)，乏氧是促進基因表達的原因之一，乏氧狀態(tài)下二者表達均升高，這與survivin主要在腫瘤細胞中表達，乏氧可使其表達狀態(tài)提高的結論相一致[12-13]。而HIF-1α基因表達下調后，survivin的表達亦下調，說明HIF-1α表達與survivin基因有關[14-15]。

作為HIF-1唯一的氧調節(jié)亞單位，在乏氧情況下，HIF-1α的表達增強，可以與細胞核內乏氧反應元件相互結合，對其下游基因的表達起到上調作用，包括轉化生長因子、血管內皮生長因子等，增加腫瘤的血管生成率，增強腫瘤細胞的侵襲能力，增加放化療抵抗。通過抑制其表達可以對惡性腫瘤細胞的有絲分裂產生干擾，影響腫瘤細胞的增殖。survivin是凋亡抑制蛋白家族中的成員，是凋亡抑制因子中最強的一種，在腫瘤細胞缺氧誘導調節(jié)中起到重要的參與作用。本研究通過HE染色可以直接觀察細胞形態(tài)。對未進行基因轉染的乏氧細胞進行放射干預24 h后，細胞變性程度不明顯，提示乏氧環(huán)境可以促使細胞抵抗放射，而對HIF-1α、survivin基因干預后，細胞放射損傷反應明顯增強。

綜上所述，通過本研究可以證實乏氧環(huán)境可以提高宮頸癌SiHa細胞中HIF-1α和survivin的表達，通過siRNA轉染技術可以下調乏氧SiHa細胞中HIF-1α和survivin的表達。乏氧后細胞SER較低，而抑制HIF-1α和survivin可以提高SER，可以認為HIF-1α和survivin基因是影響SER的關鍵基因。