miRNA-129-5p通過調(diào)控肝素結(jié)合生長因子對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響機(jī)制研究

滕樹炎，陳煥文

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，重慶400060

肺癌是世界上發(fā)病率、病死率均最高的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）包括鱗狀細(xì)胞肺癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌，是肺癌的重要病理分型，占所有肺癌的80%～85%[2]。目前NSCLC的治療方法有手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等[3]，但由于大多數(shù)NSCLC患者診斷時(shí)已處于中晚期，臨床治療效果不佳[4]，因此對(duì)肺癌患者早期診斷及準(zhǔn)確預(yù)測治療后病情變化就顯得尤為重要。miRNA是一段由18～22個(gè)堿基組成的非編碼單鏈RNA，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA在多種腫瘤中差異表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中充當(dāng)致癌基因或抑癌基因，發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5]。越來越多的研究證實(shí)，miRNA與NSCLC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究報(bào)道，miRNA-129-5p 在胃癌[6]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[7]，食管鱗狀細(xì)胞癌[8]中表達(dá)下調(diào)，能夠發(fā)揮抑癌作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p在NSCLC組織中亦表達(dá)下調(diào)[9]，可影響NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移能力。肝素結(jié)合生長因子（heparin binding growth factor，HDGF）是一種具有促分裂活性的肝素結(jié)合蛋白，在NSCLC組織中高表達(dá)，可影響細(xì)胞增殖和侵襲[10-11]、血管生成[12]等生物學(xué)過程，表明HDGF在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)HDGF可能是miRNA-129-5p的靶基因，但miRNA-129-5p是否靶向調(diào)控NSCLC中HDGF蛋白參與細(xì)胞的增殖和遷移過程仍不清楚。因此，本研究旨在研究miRNA-129-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織與細(xì)胞

1.1.1 肺癌組織收集2018年3—7月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查確診為NSCLC的3例NSCLC患者的腫瘤組織（直徑約為1cm）和對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距腫瘤外緣3cm外的肺組織）石蠟標(biāo)本，3例患者均為男性，術(shù)前均未接受過放化療。

1.1.2 細(xì)胞正常支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE和NSCLC細(xì)胞株A549、H460、H1299均購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。所有細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 材料

HDGF干擾RNA（si-HDGF）和對(duì)照干擾RNA（si-NC）均由上海生物工程有限公司合成構(gòu)建。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Invitrogen Gibco公司，CCK-8試劑和胰蛋白酶均購自美國Sigma-Aldrich公司，miRNeasy Mini Kit試劑盒、總RNA提取試劑盒和miRNA實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒均購自德國QIAGEN公司，miRNA-NC、miRNA-129-5p mimics均購自廣州銳博生物公司，Cell Lysis Buffer裂解液、結(jié)晶紫染色液、蛋白濃度測定試劑盒、蛋白抽提試劑盒及電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司，HDGF抗體購自武漢博士德公司，pcDNA3.1空載體、HDGF過表達(dá)載體pcDNA3.1-HDGF、β-actin抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗和LipofectamineTM2000均購自賽默飛公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司，熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，Transwell小室購自美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 qRT-PCR檢測miRNA-129-5p和HDGF表達(dá)采用總RNA提取試劑盒和miRNeasy Mini Kit試劑盒提取16-HBE、H460、A549和H1299細(xì)胞的總RNA和miRNA，參照對(duì)應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA，按qRT-PCR試劑盒的操作步驟分別檢測細(xì)胞中HDGF和miRNA-129-5p的表達(dá)情況。HDGF和U6引物來源于miRNA qRT-PCR試劑盒，HDGF-F：5'-ATCAACAGCCAACAAATACC-3'，HDGF-R：5'-TTCTTATCACCGTCACCCT-3'；βactin-F：5'-GGACCTGACTGACTACCTC-3'，β-actin-R：5'-TACTCCTGCTTGCTGAT-3'。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染待A549和H1299細(xì)胞生長至80%融合度，以適當(dāng)密度接種至6孔細(xì)胞板中，隨機(jī)分為7組：control組（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、miRNA-NC組（轉(zhuǎn)染miRNA-NC）、miRNA-129-5p mimics組（轉(zhuǎn)染miRNA-129-5p mimics）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-HDGF組（轉(zhuǎn)染si-HDGF）、miRNA-129-5p mimics+NC組（共轉(zhuǎn)染miRNA-129-5p mimics和pcDNA3.1）、miRNA-129-5p mimics+HDGF組（共轉(zhuǎn)染miRNA-129-5p mimics和pcDNA3.1-HDGF），按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測HDGF的蛋白表達(dá)情況。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以3×105/孔密度接種至96孔細(xì)胞板中，分別于12、24、36、48、60 h時(shí)取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入20 μl的CCK-8溶液，采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在490 nm波長下的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.4 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞加入無血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度。以3×104/孔密度接種至Transwell上室中，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，小心擦去上室中的細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗后，分別用甲醇和0.5%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、染色。倒置顯微鏡觀察A549和H1299細(xì)胞的遷移能力，隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)算遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miRNA-129-5p與HDGF基因的靶向關(guān)系生物信息學(xué)分析預(yù)測庫預(yù)測miRNA-129-5p與HDGF3'-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。參照轉(zhuǎn)染試劑說明書將構(gòu)建好的野生型HDGF-3'-UTR-WT和突變型HDGF-3'-UTR-MUT的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及miRNA-NC、miRNA-129-5p mimics轉(zhuǎn)染至A549和H1299細(xì)胞6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒操作步驟檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.6 Westernblot檢測蛋白表達(dá)情況采用快速蛋白提取試劑盒提取3例NSCLC組織、對(duì)應(yīng)癌旁組織及A549和H1299細(xì)胞的總蛋白，并參照二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白的濃度。經(jīng)沸水浴變性后，取20 μg變性蛋白上樣至12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠孔中進(jìn)行電泳。經(jīng)80 V電壓電泳0.5 h后，換成120 V電壓電泳1 h。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白凝膠轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后，置于含有5%去脂奶粉的封閉液中4℃下孵育過夜。以PBST洗膜后，再在4℃下將PVDF膜轉(zhuǎn)入1∶2000稀釋的一抗中反應(yīng)過夜，經(jīng)TBST洗膜后，加入1∶10 000稀釋的二抗于37℃下孵育1 h。于暗室內(nèi)滴加化學(xué)發(fā)光劑顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J分析目的條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織、癌旁組織及細(xì)胞中miRNA-129-5p表達(dá)水平的比較

NSCLC組織中miRNA-129-5p表達(dá)水平為（0.41±0.12），低于癌旁組織中的（1.17±0.33），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.498，P＜0.05）。miRNA-129-5p在16-HBE細(xì)胞中的表達(dá)水平為（0.97±0.08），A549細(xì)胞中為（0.37±.0.04），H1299細(xì)胞中為（0.39±0.03），H460細(xì)胞中為（0.68±0.06），與正常支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE相比，細(xì)胞株A549、H1299和H460中miRNA-129-5p的表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.238、23.516、10.046，P＜0.05）。因A549和H1299細(xì)胞中miRNA-129-5p表達(dá)水平更低，故后續(xù)選取A549和H1299細(xì)胞進(jìn)行研究。

2.2 過表達(dá)miRNA-129-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

2.2.1 miRNA-129-5p轉(zhuǎn)染效果將miRNA-129-5p mimics轉(zhuǎn)染至A549和H1299細(xì)胞中，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，A549及H1299細(xì)胞中，miRNA-129-5p mimics組細(xì)胞中miRNA-129-5p表達(dá)均高于control組及miRNA-NC組，轉(zhuǎn)染效果好。

2.2.2 CCK-8法檢測 A549和H1299細(xì)胞的增殖情況結(jié)果顯示，作用24、48 h后，與同時(shí)間miRNA-NC組相比，miRNA-129-5p mimics組細(xì)胞吸光度值均降低（P＜0.05）。（表1）

2.2.3 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移情況結(jié)果表明，A549及H1299細(xì)胞中，miRNA-129-5p mimics組細(xì)胞的遷移數(shù)目均少于control組及miRNA-NC組。（圖 1）

2.3 HDGF是miRNA-129-5p的靶基因

2.3.1 NSCLC組織及癌旁組織中HDGFmRNA及HDGF蛋白表達(dá)情況的比較NSCLC組織中HDGFmRNA及HDGF蛋白表達(dá)水平分別為（5.73±1.24）、（4.76±0.28），均明顯高于癌旁組織的（1.30±0.26）、（1.18±0.12），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.724、83.099，P＜0.01）。

2.3.2 16-HBE、 A549、H1299細(xì) 胞中HDGFmRNA及HDGF蛋白表達(dá)情況的比較A549和H1299細(xì)胞中HDGFmRNA分別為（5.36±0.54）、（6.33±0.63），均明顯高于正常支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE的（1.20±0.12），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。A549和H1299細(xì)胞中HDGF蛋白表達(dá)量分別為（4.71±0.47）、（5.42±0.54），均明顯高于正常支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE的（1.00±0.10），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 Transwell法檢測培養(yǎng)24h后control組、miRNA-NC組、miRNA-129-5p mimics組 A549和H1299細(xì)胞的遷移情況（結(jié)晶紫染色，×200）

2.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測雙熒光素酶活性結(jié)果顯示，miRNA-129-5p mimics組A549、H1299細(xì)胞的HDGF-3'UTR-WT熒光素酶活性均明顯低于miRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），兩組 A549、H1299細(xì)胞HDGF-3'UTR-MUT熒光素酶活性比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表 2）

2.3.4 HDGF蛋白表達(dá)水平的比較miRNA-129-5p mimics組A549、H1299細(xì)胞中HDGF蛋白表達(dá)水平分別為（0.61±0.13）、（0.54±0.15），均明顯低于miRNA-NC組的（1.35±0.12）、（1.26±0.23），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 沉默HDGF對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

2.4.1 si-HDGF轉(zhuǎn)染效果Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與si-NC組相比，轉(zhuǎn)染了干擾RNA的si-HDGF組A549和H1299細(xì)胞，HDGF蛋白表達(dá)下調(diào)。（圖2）

表1 control組、miRNA-NC組、miRNA-129-5p mimics組 A549及 H1299細(xì)胞吸光度值的比較（±s）

表1 control組、miRNA-NC組、miRNA-129-5p mimics組 A549及 H1299細(xì)胞吸光度值的比較（±s）

注：*與同時(shí)間miRNA-NC組比較，P＜0.05

組別control組miRNA-NC組miRNA-129-5p mimics組F值P值0.23±0.01 0.24±0.02 0.23±0.02 1.333 0.277 0.61±0.04 0.56±0.02 0.40±0.04*120.333 0.000 1.06±0.04 0.95±0.04 0.62±0.04*393.250 0.000 0.25±0.01 0.25±0.02 0.25±0.01 0.000 1.000 0.62±0.04 0.56±0.03 0.42±0.02*130.759 0.000 0.98±0.03 0.91±0.04 0.62±0.05*262.320 0.000 A549細(xì)胞H1299細(xì)胞0 h 24 h 48 h 0 h 24 h 48 h

表2 miRNA-NC組、miRNA-129-5p mimics組 A549、 H1299細(xì)胞雙熒光素酶活性的比較（±s）

表2 miRNA-NC組、miRNA-129-5p mimics組 A549、 H1299細(xì)胞雙熒光素酶活性的比較（±s）

組別miRNA-NC組miRNA-129-5p mimics組t值P值0.99±0.04 0.41±0.03 34.800 0.000 1.00±0.06 1.01±0.07 0.325 0.749 0.99±0.07 0.37±0.03 24.423 0.000 1.00±0.04 1.02±0.05 0.937 0.363 A549細(xì)胞HDGF-3'UTR-WT HDGF-3'UTR-MUT H1299細(xì)胞HDGF-3'UTR-WT HDGF-3'UTR-MUT

圖2 Western blot檢測control組、si-NC組、si-HDGF組A549、 H1299細(xì)胞中HDGF蛋白的表達(dá)情況

2.4.2 CCK-8法檢測 A549和H1299細(xì)胞的增殖情況結(jié)果顯示，作用24、48 h后，與同時(shí)間si-NC組相比，si-HDGF組細(xì)胞吸光度值均降低（P＜0.05）。（表3）

2.4.3 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移情況結(jié)果表明，A549及H1299細(xì)胞中，si-HDGF組細(xì)胞的遷移數(shù)目均少于control組及si-NC組。（圖3）

圖3 Transwell法檢測培養(yǎng)24h后control組、si-NC組、si-HDGF組 A549和 H1299細(xì)胞的遷移情況（結(jié)晶紫染色，×200）

2.5 miRNA-129-5p負(fù)調(diào)控HDGF對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

2.5.1 CCK-8法檢測 A549和H1299細(xì)胞的增殖情況作用24、48 h后，與同時(shí)間miRNA-129-5p mimics+NC組相比，miRNA-129-5p mimics+HDGF組A549、H1299細(xì)胞的吸光度值均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表4）

2.5.2 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移情況用結(jié)晶紫對(duì)遷移細(xì)胞染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miRNA-129-5p mimics+NC組相比，miRNA-129-5p mimics+HDGF組A549和H1299細(xì)胞的遷移顯著增加。（圖4）

圖4 Transwell法檢測培養(yǎng)24h后miRNA-129-5p mimics+NC組與miRNA-129-5p mimics+HDGF 組 A549和H1299細(xì)胞的遷移情況（結(jié)晶紫染色，×200）

3 討論

研究表明，miRNA-129-5p在多種腫瘤中能夠發(fā)揮抗腫瘤作用，如Diao等[6]發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p能夠通過負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)化生長相互作用因子2（transformation growth interacting factors 2，TGIF2）的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲與凋亡；Chen等[13]發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p通過溶質(zhì)載體家族2，促進(jìn)溶質(zhì)載體家族2成員3（solute carrier family 2 member 3，SLC2A3）蛋白調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的糖酵解和細(xì)胞增殖；Brest等[14]報(bào)道m(xù)iRNA-129-5p在甲狀腺癌組織中表達(dá)降低；路璐等[15]發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p可明顯增強(qiáng)紫杉醇抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。此外，Ma等[16]發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p通過其靶基因delta類似非經(jīng)典Notch配體1（delta like non-canonical Notch ligand 1，DLK1），抑制NSCLC細(xì)胞的耐藥性，并且通過靶向基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP9）、微球蛋白1（microspherule protein 1，MCRS1）等調(diào)控NSCLC的增殖和侵襲，表明miRNA-129-5p在NSCLC細(xì)胞中能夠發(fā)揮抑癌作用。本研究通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，3株NSCLC細(xì)胞株A549、H460和H1299中miRNA-129-5p均低表達(dá)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇miRNA-129-5p低表達(dá)較為顯著的A549和H1299細(xì)胞作為研究對(duì)象，miRNA-129-5p mimics轉(zhuǎn)染上調(diào)miRNA-129-5p的表達(dá)，CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測其對(duì)A549和H1299細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miRNA-129-5p可以顯著抑制細(xì)胞增殖和遷移能力，提示miRNA-129-5p在NSCLC中能夠發(fā)揮抑癌作用。

表3 control組、si-NC組、si-HDGF組 A549、 H1299細(xì)胞吸光度值的比較（±s）

表3 control組、si-NC組、si-HDGF組 A549、 H1299細(xì)胞吸光度值的比較（±s）

注：*與同時(shí)間si-NC組比較，P＜0.05

組別control組si-NC組si-HDGF組F值P值0.25±0.02 0.25±0.02 0.25±0.02 0.000 1.000 0.57±0.03 0.51±0.03 0.35±0.04*102.706 0.000 0.96±0.04 0.87±0.04 0.51±0.04*318.938 0.000 0.25±0.01 0.25±0.01 0.25±0.01 0.000 0.000 0.61±0.03 0.52±0.03 0.37±0.04*116.735 0.000 1.08±0.04 0.94±0.03 0.56±0.04*476.781 0.000 A549細(xì)胞H1299細(xì)胞0 h 24 h 48 h 0 h 24 h 48 h

表4 miRNA-129-5p mimics+NC 組與miRNA-129-5p mimics+HDGF 組 A549、 H1299細(xì)胞吸光度值的比較（±s）

表4 miRNA-129-5p mimics+NC 組與miRNA-129-5p mimics+HDGF 組 A549、 H1299細(xì)胞吸光度值的比較（±s）

組別miRNA-129-5p mimics+NC組miRNA-129-5p mimics+HDGF組t值P值0.25±0.03 0.24±0.03 0.707 0.490 0.40±0.06 0.53±0.05 4.993 0.000 0.67±0.03 0.99±0.05 16.464 0.000 0.25±0.03 0.26±0.03 0.707 0.490 0.36±0.05 0.47±0.03 5.3660 0.000 0.61±0.04 0.87±0.05 12.182 0.000 A549細(xì)胞H1299細(xì)胞0 h 24 h 48 h 0 h 24 h 48 h

有研究報(bào)道HDGF廣泛存在于多種正常組織及惡性腫瘤中，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和新生血管生成的作用[17]，與多種惡性腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。先前有研究發(fā)現(xiàn)HDGF在NSCLC組織中高表達(dá)，miRNA-195[18]和miRNA-497[19]能夠靶向調(diào)控HDGF從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。但是關(guān)于miRNA-129-5p是否能夠通過調(diào)控HDGF從而進(jìn)一步影響NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移，目前仍不清楚。本研究通過靶基因預(yù)測軟件檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p與HDGF3'-UTR存在互補(bǔ)的核苷酸序列，推測HDGF可能是miRNA-129-5p的潛在靶基因，miRNA-129-5p可能通過靶向HDGF參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了HDGF是miRNA-129-5p的靶基因，過表達(dá)miRNA-129-5p可以抑制HDGF的表達(dá)。沉默HDGF可以抑制NSCLC細(xì)胞A549和H1299的增殖和遷移能力，與過表達(dá)miRNA-129-5p結(jié)果一致，提示HDGF在NSCLC細(xì)胞A549和H1299的增殖和遷移過程中具有重要作用。此外，共轉(zhuǎn)染miRNA-129-5p mimics和pcDNA3.1-HDGF后發(fā)現(xiàn)，HDGF可部分逆轉(zhuǎn)miRNA-129-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞A549和H1299增殖和遷移的抑制作用，提示miRNA-129-5p可以通過負(fù)調(diào)控HDGF表達(dá)參與其中，表明miRNA-129-5p能夠靶向調(diào)控HDGF的表達(dá)從而影響NSCLC細(xì)胞A549和H1299的增殖和遷移能力。

miRNA-129-5p在NSCLC中的作用已有報(bào)道[20]，但是以miRNA-129-5p為NSCLC治療靶點(diǎn)的理論依據(jù)還不充足。miRNA-129-5p調(diào)控NSCLC的機(jī)制十分復(fù)雜，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-129-5p可通過下調(diào)HDGF的表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞A549和H1299的增殖和遷移，但其下游可能存在的信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為NSCLC的診斷和治療提供了新的科學(xué)依據(jù)，后期將會(huì)繼續(xù)致力于miRNA-129-5p對(duì)NSCLC調(diào)控機(jī)制的研究。