DNMT1通過miRNA-148b-3p調(diào)控腦膠質(zhì)瘤 U87細胞替莫唑胺耐藥性的作用機制

彭耀中，杜鵬，張學勇

聊城市第二人民醫(yī)院1檢驗科，2腫瘤科，山東聊城252600

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人腦膠質(zhì)瘤U87細胞系購自美國模式菌種收集中心（American TypeCultureCollection，ATCC）。TMZ、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒均購自美國Sigma公司，噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）、LipofectamineTM2000試劑均購自美國Invitrogen公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Trizol試劑購自美國Life Technology公司，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、pcDNA-DNMT1過表達載體均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，實時定量聚合酶鏈反應（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）儀購自美國BD公司，RNA提取試劑盒、TaqMan?miRNA試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒、細胞凋亡試劑盒均購自美國Omega生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 U87/TMZ耐藥細胞培養(yǎng)將人腦膠質(zhì)瘤U87細胞系培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代一次。收集對數(shù)生長期的人腦膠質(zhì)瘤U87細胞系，1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為1×107/ml，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，加入5 μmol/L誘導劑量的TMZ，培養(yǎng)15～20天后，采用終濃度為10、20、40、80、160、320 μmol/L的TMZ溶液處理細胞，每個梯度濃度培養(yǎng)15～20天，最終獲得穩(wěn)定生長的U87/TMZ耐藥細胞系，TMZ最佳濃度為20 μmol/L。

1.2.2 流式細胞儀檢測U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞的凋亡情況采用20 μmol/L的TMZ分別作用于U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞，胰蛋白酶消化后置入離心管中，2000 r/min離心5 min，除去上清液。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3次，加入 400 μl的結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸細胞，加入5μl的 Annexin VFITC，4℃避光孵育20 min。上機檢測前5 min，加入5 μl的PI染液，采用流式細胞儀檢測U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR法檢 測MDR1、DNMT1、Bcl-2mRNA和miRNA-148b-3p的相對表達量取對數(shù)生長期的U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞，Trizol法提取總RNA，測定mRNA濃度和純度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），根據(jù)熒光定量RT-PCR試劑盒說明書進行擴增。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)45次，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算MDR1、DNMT1、Bcl-2mRNA和miRNA-148b-3p的相對表達量。引物序列如下：MDR1正向引物為5'-CTTGGCATTGAGTGAAAGAAC-3'，反向引物為5'-ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA-3'；Bcl-2正向引物為 5'-CATTGGGAGTTTCAAATCAGC-3'，反向引物為5'-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3'；DNMT1正向引物為5'-CTCCCTATTGTAAACTTGT-3'，反向引物為5'-ATAGGGTTCATTCCCATACG-3'；miRNA-148b-3p正向引物為5'-TGACTGGATTCGCTAGGTAGAAG-3'，反向引物為 5'-GGCAATTTTCAGAGCTATTAG-3'。

1.2.4 DNMT1抑制劑5-Aza-CdR處理U87細胞取對數(shù)生長期的U87細胞，加入2 μ mol/L的DNMT1抑制劑5-Aza-CdR處理24 h，收集細胞，RT-PCR法檢測miRNA-148b-3p的相對表達量。

1.2.5 U87/TMZ耐藥細胞轉(zhuǎn)染和分組方法轉(zhuǎn)染前1天，將U87/TMZ耐藥細胞接種至6孔板，5×105/孔，培養(yǎng)24 h，待融合度為50%～60%時，將空質(zhì)粒、LipofectamineTM2000試劑和pcDNA-DNMT1過表達載體分別轉(zhuǎn)染至U87/TMZ耐藥細胞，并分別作為空白對照組、陰性對照組和pcDNA-DNMT1組，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。

1.2.6 甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation specific polymerase chain reaction ，MSP）法檢測U87/TMZ耐藥細胞miRNA-148b-5p啟動子區(qū)甲基化水平取對數(shù)生長期的空白對照組、陰性對照組和pcDNA-DNMT1組U87/TMZ耐藥細胞，Trizol法提取總RNA，取800 μl去離子水加入至亞硫酸氫鈉混合物中，充分混勻、溶解。配置140 μl反應體系：85μl亞硫酸氫鈉混合物，35 μl DNA緩沖液，5 μl DNA 溶液，15 μl RNase-free水；反應條件：95℃ 5 min，60℃ 25 min，95℃ 5 min，60℃ 85 min，95℃5 min，60℃175 min。然后將反應液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入560 μl新鮮配制的緩沖液，混勻；將反應產(chǎn)物分別裝入離心管中；3000 r/min離心5 min，除去收集柱中的液體；65℃烤箱中烘干；洗滌，收集離心管中的反應產(chǎn)物，將反應產(chǎn)物置于-80℃保存?zhèn)溆?。?0 μl的反應體系（Taq Mix10 μl+cDNA模板2 μl+上下游引物1 μl+7 μl RNase-free水），反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸5 min，循環(huán)40次。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算3組U87/TMZ耐藥細胞miRNA-148b-3p啟動子區(qū)甲基化水平。

1.2.7 MTT法檢測U87/TMZ耐藥細胞的增殖能力取對數(shù)生長期的空白對照組、陰性對照組和pcDNA-DNMT1組U87/TMZ耐藥細胞，接種至96孔板中，1×104/孔，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每組設置8個復孔，培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為 10、20、40、80、160 μmol/L（因預實驗顯示，160 μmol/L 的 TMZ處理細胞時，pcDNA-DNMT1組細胞的增殖抑制率已經(jīng)達到平臺期，因此，未采用320 μmol/L的TMZ處理細胞）的TMZ溶液，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl的MTT，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl的DMSO溶液，置于振動器上振動5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結(jié)晶物。采用酶標儀于570 nm的波長處測量光密度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率（%）=1-OD值TMZ處理組/OD值空白組×100%。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

利用GRNN網(wǎng)絡進行的瓦斯涌出預測結(jié)果接近實際值，最大誤差僅有8%左右，可以用于瓦斯涌出量預測的實際生產(chǎn)中去[6]。在整個網(wǎng)絡的訓練中，GRNN網(wǎng)絡需要調(diào)整的參數(shù)只有一個光滑因子，因而有較快的收斂速度，可以更快地訓練出合適的網(wǎng)絡。在調(diào)用GRNN網(wǎng)絡時，需要輸入的設計參數(shù)只有一個擴展常數(shù)，使得網(wǎng)絡的形成受到的人為主觀影響較小，使得在預測中有更大的優(yōu)勢。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀檢測U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞的凋亡情況

經(jīng)20μmol/L的TMZ處理U87細胞和U87/TMZ耐藥細胞后，U87/TMZ耐藥細胞的凋亡率為（1.84±1.11）%，明顯低于 U87細胞的（15.47±2.09）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.291，P＜0.01）。

2.2 MDR1、Bcl-2mRNA相對表達量的比較

U87/TMZ耐藥細胞中MDR1mRNA的相對表達量為（2.26±0.19），明顯高于U87細胞的（0.65±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（t=19.295，P＜0.01）。U87/TMZ耐藥細胞中Bcl-2mRNA的相對表達量為（1.34±0.15），明顯高于U87細胞的（0.73±0.16），差異有統(tǒng)計學意義（t=7.867，P＜0.01）。

2.3 DNMT1mRNA和miRNA-148b-3p相對表達量的比較

U87細胞miRNA-148b-3p的相對表達量為（0.63±0.18），明顯低于 U87/TMZ耐藥細胞的（2.44±0.15），差異有統(tǒng)計學意義（t=21.849，P＜0.01）。U87細胞DNMT1mRNA的相對表達量為（1.15±0.17），明顯高于 U87/TMZ耐藥細胞的（0.84±0.13），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.097，P＜0.01）。

2.4 DNMT1抑制劑5-Aza-CdR對U87細胞miR-NA-148b-3p相對表達量的影響

5-Aza-CdR處理后的U87細胞的miRNA-148b-3p相對表達量為（1.84±0.12），明顯高于未經(jīng)5-Aza-CdR處理的U87細胞的（0.57±0.10），差異有統(tǒng)計學意義（t=22.996，P＜0.01）。

2.5 MSP法檢測U87/TMZ耐藥細胞miRNA-148b-5p啟動子區(qū)的甲基化水平

MSP法檢測結(jié)果顯示，pcDNA-DNMT1組U87/TMZ耐藥細胞中miRNA-148b-3p啟動子區(qū)甲基化水平為（0.64±0.17），高于空白對照組的（0.43±0.12）和陰性對照組的（0.45±0.11），差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.854、2.654，P＜0.05）。

2.6 MTT法檢測U87/TMZ耐藥細胞的增殖能力

不同濃度TMZ溶液處理的pcDNA-DNMT1組U87/TMZ細胞的增殖抑制率，均明顯高于空白對照組和陰性對照組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同濃度TMZ處理 3組 U87/TMZ耐藥細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表1 不同濃度TMZ處理 3組 U87/TMZ耐藥細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.01；b與陰性對照組比較，P＜0.01

TMZ濃度（μmol/L）10 20 40 80 160 1.29±1.20 3.50±1.36 18.24±4.65 43.77±8.10 54.89±8.79 2.33±1.15 4.38±1.40 17.26±4.81 42.18±7.25 53.46±8.12 14.48±3.47a b 20.04±4.18a b 45.85±7.31a b 78.81±6.05a b 79.26±6.80a b空白對照組陰性對照組pcDNA-DNMT1組

3 討論

對于惡化程度較高的膠質(zhì)瘤患者，臨床多采用手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療方案，其中烷化劑是最常用的化療藥物，TMZ屬于第二代咪唑并四嗪類烷化劑，且是臨床治療腦膠質(zhì)瘤的一線化療藥物[6]。TMZ口服后可代謝為5-（3-甲基三氮烯-1-基）咪唑-4-甲酰胺，導致腫瘤細胞DNA中鳥嘌呤的O6位和N7位發(fā)生甲基化，從而發(fā)揮細胞毒性作用[7]。但在實際臨床中，超過30%的患者易對TMZ產(chǎn)生耐藥性，是腦膠質(zhì)瘤患者化療失敗的主要原因。尋找預防高TMZ耐藥性的靶點，是進行個體化治療、提高患者預后的關(guān)鍵。

近年來，隨著基因組學和表觀遺傳學的不斷發(fā)展，基因甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點。與遺傳學改變不同，基因甲基化過程中核苷酸序列未發(fā)生變化，而是通過DNA甲基化、染色體重構(gòu)和組蛋白去乙?；日{(diào)控相關(guān)基因的表達，參與機體的病理生理過程[8]。DNA甲基化在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其可通過調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達，參與腫瘤細胞生長、增殖、凋亡等生物學過程[9]。本研究首先通過梯度濃度化療藥物遞增誘導法建立了人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87對TMZ耐藥的細胞系，即U87/TMZ耐藥細胞系，并通過檢測MDR1、Bcl-2mRNA的相對表達量驗證細胞對TMZ的耐藥性。MDR1基因編碼的P糖蛋白可在細胞內(nèi)形成藥泵，從而將化療藥物泵出細胞外，從而使細胞產(chǎn)生耐藥性；同時P糖蛋白可以使細胞內(nèi)環(huán)境堿化，以降低細胞對化療藥物的敏感性[10]。Bcl-2基因則屬于細胞凋亡相關(guān)基因，與抑制腫瘤細胞凋亡密切相關(guān)，Bcl-2表達上調(diào)，腫瘤細胞藥物抗性增強[11]。本研究中，U87/TMZ耐藥細胞中MDR1、Bcl-2mRNA的相對表達量均明顯高于U87細胞，表明U87/TMZ細胞具有較強的TMZ耐藥性。

腦膠質(zhì)瘤對TMZ的耐藥機制較為復雜，除與DNA損傷修復途徑有關(guān)外，表觀遺傳調(diào)控也在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。近年來，miRNA與化療藥物的敏感性和耐藥性密切相關(guān)已被臨床廣泛認可。在前期研究中，研究小組通過靶基因預測數(shù)據(jù)庫Target Scan和microrna，發(fā)現(xiàn)miRNA-148b-3p與DNMT1存在互補序列，推測二者可能存在靶向關(guān)系[13]。miRNA-148b是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA，屬于miRNA-148家族成員之一，在不同組織中的表達水平存在明顯差異[14]。前體miRNA-148b定位于染色體12q13.13，包括miRNA-148b-3p和miRNA-148p-5p[15]。既往研究表明，miRNA-148b-3p通過靶向WNT1/β-catenin信號通路，抑制肝癌細胞的增殖和侵襲[16]。在本研究中，U87細胞中miRNA-148b-3p的相對表達量明顯低于U87/TMZ耐藥細胞，但DNMT1miRNA的相對表達量卻明顯高于U87/TMZ耐藥細胞，將DNMT1抑制劑5-Aza-CdR作用于U87細胞，發(fā)現(xiàn)U87細胞miRNA-148b-3p的相對表達量明顯升高；同時，將pcDNA-DNMT1過表達載體轉(zhuǎn)染至U87/TMZ耐藥細胞珠，結(jié)果顯示，U87/TMZ耐藥細胞miRNA-148b-3p啟動子區(qū)域甲基化水平升高。表明DNMT1基因可能通過調(diào)節(jié)miRNA-148b-3p啟動子區(qū)域甲基化水平調(diào)節(jié)miRNA-148b-3p的相對表達量，從而進一步影響腫瘤細胞的增殖能力。DNMT1介導的DNA甲基化是表觀遺傳學基因調(diào)控的重要手段，在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對TMZ耐藥過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。

綜上所述，DNMT1與miRNA-148b-3p的表達密切相關(guān)，DNMT1可通過調(diào)節(jié)miRNA-148b-3p啟動子區(qū)甲基化水平負性調(diào)控miRNA-148b-3p的相對表達量，從而控制人腦膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的耐藥性。miRNA-148b-3p可能作為預測腦膠質(zhì)瘤對TMZ治療敏感性的參考指標之一，為臨床個體化治療提供新的思路。