黏管藻的分子鑒定與生長特性研究

王昊林 卞 瑤 王永宇 李佳俊 王宏偉

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 大連 116081)

黏管藻[Gloiosiphonia capillaris(Hudson) Carmichael]隸屬于紅藻門(Rhodophyta), 杉藻目(Gigartinales), 黏管藻科(Gloiosiphoniaceae), 黏管藻屬(GloiosiphoniaCarmichael)。廣泛分布于大西洋和太平洋, 國內(nèi)主要分布于遼寧、山東、福建, 生長在潮間帶的石沼中[1]。目前黏管藻屬在全世界共報道了3個種, 模式種為黏管藻[G. capillaris(Hudson)Carmichael], 另外2個種為加利福尼亞黏管藻[G.californica(Farlow) J. Agardh]和輪生黏管藻(G.verticillarisFarlo)。對于黏管藻的研究源于18世紀(jì)70年代。Hudson[2]在英國發(fā)現(xiàn)了該種, 并將其命名為Fucus capillarisHudson。Berkeley[3]發(fā)現(xiàn)F. capillarisHudson的形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于墨角藻屬(Fucus)的其他種, 依據(jù)該種建立了黏管藻屬并將該種作為黏管藻屬的模式種。Edelstein[4]對黏管藻的生活史進行了研究, 發(fā)現(xiàn)黏管藻生活史為異型世代交替, 其四分孢子體為殼狀。夏邦美[1]與曾呈奎[5]對黏管藻的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行了研究。Saunders等[6]對產(chǎn)自加拿大的黏管藻的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶大亞基(rbcL)基因序列進行了分析, 從分子水平明確了其分類地位。

隨著近幾年大連海域海洋資源的過度開發(fā)以及圍填海等行為, 在謀求社會發(fā)展和經(jīng)濟效益的同時也導(dǎo)致了近海岸海洋生態(tài)系統(tǒng)功能退化以及海水富營養(yǎng)化形勢加劇[7]。環(huán)境的劇烈變化導(dǎo)致大連海域潮間帶大型底棲海藻的物種組成以及群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變, 如大連獐子島沿岸叉節(jié)藻(Amphiroa zonata)、柔質(zhì)仙菜(Ceramium tenerrimum)等海藻分布范圍越來越小甚至消失, 石莼(Ulva lactuca)、滸苔(Ulva prolifera)等海藻大量繁殖, 綠潮現(xiàn)象越來越嚴重[8]。藻類的大量繁殖會帶來嚴重的危害,如強壯硬毛藻(Chaetomorpha valida)的大量繁殖給大連瓦房店和復(fù)州灣的海參養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[9], 滸苔(U. prolifera)的大規(guī)模暴發(fā)引發(fā)綠潮災(zāi)害, 給黃海近岸海域造成了嚴重的社會影響[10],同時藻類的大量死亡會消耗水體中的溶解氧, 導(dǎo)致水體表層和底層的物理、化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生不利變化[11]。筆者在標(biāo)本的采集調(diào)查時發(fā)現(xiàn)大連海域刺松藻(Codium fragile)、海蘿(Gloiopeltis furcate)、亮管藻(Hyalosiphonia caespitosa)等常見海藻的分布范圍由于海洋生態(tài)環(huán)境的惡化而變得越來越小, 甚至消失。因此有必要對大連海域海藻的種類、分布及生物量等進行詳細調(diào)查與評估, 達到物種保護和災(zāi)害預(yù)防的目的。黏管藻作為大型經(jīng)濟海藻, 在大連沿岸廣泛分布, 其含有的生物活性物質(zhì)具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和免疫抑制的作用[12]。但關(guān)于其生長狀態(tài)、資源現(xiàn)狀、生長周期與繁殖盛期、溫度性質(zhì)等研究未見報道。本研究將對分布在大連沿岸的黏管藻的外部形態(tài)、營養(yǎng)與生殖結(jié)構(gòu)、生物量、成熟個體比例與成熟個體生物量/總生物量(R/T指數(shù))的變化、溫度性質(zhì)等進行詳細研究, 并通過rbcL和COⅠ基因序列分析結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)對其進行準(zhǔn)確的鑒定。研究結(jié)果將明確大連沿岸黏管藻的資源現(xiàn)狀; 確定其生長周期與繁殖盛期, 為其物種的保護和繁育提供理論依據(jù); 確定黏管藻在海洋水體污染的監(jiān)測中的作用和地位, 為海洋生態(tài)環(huán)境的監(jiān)測提供理論依據(jù), 為分布于全國其他海域的黏管藻的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 采集地點

本研究樣本均采自遼寧省大連海域礁石較多、生態(tài)環(huán)境保護較好的區(qū)域。采集地點的布設(shè)如圖 1所示, 共布設(shè)了6個采集地點, 分別位于黑石礁(121°34′7.91″E, 38°52′40.5″N)、付家莊(121°37′58.3″E, 38°52′8.77″N)、石槽(121°41′51.0″E,38°52′24.7″N)、金石灘(122°1′54.8″E, 39°5′6.15″N)、獐子島(122°43′25.9″E, 39°1′32.6″N)和海洋島(123°9′56.4″E, 39°4′27.7″N)。

1.2 樣本的采集與處理

根據(jù)海洋生物調(diào)查規(guī)范[13], 在2016年3月至2018年2月每個月大潮期間進行樣本采集, 包括定性采集和定量采集。

定性采集： 黏管藻生長在潮間帶的巖石上或石沼中(圖 2A)。參照王永宇等[14]的方法, 選擇結(jié)構(gòu)完整的藻體進行采集, 將藻體在解剖鏡下清理干凈。部分新鮮藻體用于制作冰凍切片, 使用光學(xué)顯微鏡(Olympus BH2)觀察藻體的內(nèi)部結(jié)構(gòu), 用照相機(Nikon HFX-ⅡA)拍攝照片并記錄結(jié)果, 另一部分制成硅膠干燥標(biāo)本, 用于分子分析。選擇結(jié)構(gòu)完整的藻體制成臘葉標(biāo)本并編號, 保存于遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物標(biāo)本館(LNU)。

定量采集： 參照王永宇等[14]的方法, 在每個采集地點黏管藻生長旺盛的區(qū)域布設(shè)2個25 cm×25 cm的樣方(圖 2B), 采集樣方內(nèi)的黏管藻, 用吸水紙吸干藻體表面水分, 放置在65℃的烘干箱中干燥24h,稱重并記錄每個樣方內(nèi)黏管藻的生物量。統(tǒng)計每個樣方內(nèi)成熟藻體的數(shù)目, 并計算成熟個體比例與R/T指數(shù)(成熟個體的生物量/總生物量)[15]。

1.3 DNA提取與PCR擴增

使用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)進行藻體DNA的提取, 將提取到的DNA進行PCR擴增。引物設(shè)計參照姜朋[16]的方法, 引物組合如表 1所示, 均由上海生工生物公司合成。rbcL與COⅠ基因的PCR反應(yīng)程序參照王永宇等[14]的方法,檢測后的樣品均由上海生工生物公司純化和測序。

1.4 rbcL、COⅠ基因序列分析

從每個采集地點選取2個黏管藻樣本, 獲得12條rbcL序列與12條COⅠ序列。從GenBank中獲取了5個種的rbcL序列、3個種的COⅠ序列(表 2)。獲取rbcL序列的物種包括產(chǎn)自加拿大的黏管藻、產(chǎn)自美國的黏管藻屬的輪生黏管藻、產(chǎn)自加拿大黏管藻科的Plagiospora gracilis, 而產(chǎn)自加拿大的亮管藻(H. caespitosa)和Schimmelmannia plumosa則作為外群種。獲取COⅠ序列的物種包括產(chǎn)自加拿大的黏管藻屬的輪生黏管藻, 產(chǎn)自山東青島的亮管藻和產(chǎn)自加拿大的S. plumosa則作為外群種。應(yīng)用軟件Clustalx (1.83)進行序列比對, MEGA6.0進行堿基差異度分析及構(gòu)建系統(tǒng)樹, 使用最大似然法Maximum likelihood (ML)法、臨近法Neighbor joining(NJ)法和最大簡約法Maximum parsimony (MP)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。計算遺傳距離模型為Number of differences和Kimura 2-Parameter, Substitutions Type為d：Transitions+Transversions, Bootstrap重復(fù)1000次[13]。

2 結(jié)果

2.1 黏管藻配子體個體形態(tài)的變化

六個采集地點的黏管藻配子體均直立, 單生或叢生, 質(zhì)地膠質(zhì), 紅色或紫紅色, 固著器呈圓盤狀。主軸明顯, 線形圓柱狀或亞圓柱狀。分枝較密, 以對生、互生的方式排列在軸的所有面, 所有分枝又密被有與它們相似的較短的次分枝。但不同采集地點的配子體長度和寬度存在差異, 采自獐子島與海洋島的配子體在長度和寬度上明顯高于其他4個采集地點(表 3)。四分孢子體殼狀, 很難確定所采集的殼狀海藻是否為黏管藻, 故不做研究。

3月初, 配子體幼苗開始出現(xiàn), 藻體長度小于1 cm(圖 3A)。3月中旬, 藻體出現(xiàn)分枝, 藻體長度達到2—2.6 cm (圖 3B)。3月末, 藻體長度達到3.7—4.2 cm(圖 3C)。4月下旬, 藻體長度達到3.8—6.3 cm, 部分藻體上可發(fā)現(xiàn)成熟的囊果(圖 3D)。5月, 藻體快速生長, 藻體長度達到5.2—9.1 cm, 囊果集中成熟(圖 3E)。6月, 藻體長度達到6—15 cm (圖 3F), 其中最大長度可達20 cm (圖3G), 囊果全部發(fā)育成熟。7月, 當(dāng)黏管藻的果孢子釋放完成后, 藻體顏色逐漸變淺, 腐爛消失。8月至次年2月未采集到黏管藻配子體。

2.2 黏管藻配子體的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)與生殖結(jié)構(gòu)

營養(yǎng)結(jié)構(gòu)： 從次分枝頂端的橫切面觀中可以觀察到一個近圓形的中軸細胞以及四個圍軸細胞, 圍軸細胞和中軸細胞呈十字形排列, 在中軸細胞和圍軸細胞間可觀察到假根絲細胞(圖 4A)。圍軸細胞逐漸衍生成排列緊密的皮層細胞, 在衍生完畢后,圍軸細胞消失。在次分枝中端只能觀察到皮層細胞、中軸細胞和假根絲細胞(圖 4B)。在次分枝末端中軸細胞消失, 只能觀察到皮層細胞以及假根絲細胞(圖 4C)。分枝與次分枝營養(yǎng)結(jié)構(gòu)一致。從主枝上端的橫切中可以觀察到髓部從中間開始分裂(圖4D)。主枝上端至末端內(nèi)部中空呈管狀, 藻體橫切呈橢圓形(圖 4E)。皮層由6—10層細胞組成, 厚度為45—80 μm, 外皮層由2—3層排列緊密的圓形或橢圓形細胞構(gòu)成, 內(nèi)皮層由4—7層不規(guī)則的近方形或卵形細胞構(gòu)成。髓部充滿疏松排列的髓絲, 長15—50 μm, 寬2—3 μm, 在髓部可以觀察到假根絲細胞(圖 4F)。

圖 2 黏管藻的野外生境與樣方設(shè)置Fig. 2 The wild habitat and setting of the quadrat (25 cm×25 cm) for G. capillaris sampling

生殖結(jié)構(gòu)： 黏管藻配子體雌雄同體, 囊果突出藻體表面, 呈球形或半球形, 通常2—4個囊果聚集在一起。果胞枝生殖枝叢與輔助細胞生殖枝叢均由內(nèi)皮層細胞產(chǎn)生。果胞枝生殖枝叢主枝較短包含3個細胞, 生長于一個較大的顏色較深的支持細胞上, 最上面是一個帶有一條細長受精絲的較小的果胞, 其下有一個下位細胞, 受精絲伸直或彎曲指向藻體表面(圖 4G)。輔助細胞生殖枝叢主枝較長,包含6個細胞, 輔助細胞枝末端細胞為輔助細胞。輔助細胞帶有3—4個由2—5個細胞組成的側(cè)枝(圖 4H)。在受精后, 果胞產(chǎn)生聯(lián)絡(luò)絲, 進而與輔助細胞相連, 輔助細胞與枝叢主枝上的其他細胞融合并逐漸形成一個延伸的融合復(fù)合體。該復(fù)合體末端產(chǎn)生產(chǎn)孢絲, 產(chǎn)孢絲末端形成果孢子, 輔助細胞生殖枝叢的側(cè)枝與周圍的髓絲相互連接和纏繞, 形成嚢果被包圍果孢子(圖 4I)。果孢子不斷增多, 可以觀察到融合完畢的融合復(fù)合體(圖 5J)。成熟囊果近球形, 直徑100—140 μm。果孢子卵圓形, 直徑6—9 μm (圖 5K)。囊果成熟后果孢子通過囊孔釋放。精子囊未見。

表 1 rbcL與COⅠ序列擴增所需引物Tab. 1 Primers used in the study

2.3 黏管藻配子體的生物量、成熟個體比例與R/T指數(shù)的變化

通過統(tǒng)計3—7月每個采集地點每個樣方內(nèi)的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn), 3—6月, 黏管藻的平均生物量一直增大,6月平均生物量達到頂峰, 平均生物量為3.628 g/m2(表 4), 其中獐子島和海洋島采集點的黏管藻的生物量最高, 分別為4.023和4.132 g/m2。7月隨著海水溫度升高, 平均生物量減小, 8月至次年2月未采集到黏管藻個體。

當(dāng)黏管藻配子體上出現(xiàn)生殖器官果胞與精子囊時, 藻體即成熟。4月下旬黏管藻配子體開始出現(xiàn)生殖器官, 樣方內(nèi)成熟個體比例為10% (表 5),R/T指數(shù)為9% (表 6)。5月囊果集中成熟, 成熟個體比例為61%,R/T指數(shù)為60%。6月份藻體全部成熟,成熟個體比例及R/T指數(shù)均為100%。

表 2 rbcL、COⅠ基因序列分析所用物種、采集地點及基因庫登錄號列表Tab. 2 List of species for rbcL and COⅠ gene sequence analysis with the sample location and the accession numbers of GenBank

2.4 黏管藻配子體的溫度性質(zhì)分析

海藻的溫度性質(zhì)是海藻區(qū)系性質(zhì)中最主要的一項[13]。關(guān)于海藻的區(qū)系的溫度性質(zhì), 可分為寒帶區(qū)系(＜0—5℃)、亞寒帶區(qū)系(5—10℃)、溫帶區(qū)系(10—20℃)、亞熱帶區(qū)系(20—30℃)和熱帶區(qū)系(25—30℃或以上)[17]。黏管藻主要分布在黃海、渤海、東海沿岸, 黏管藻配子體的生長周期為3—7月,以大連市為例, 根據(jù)大連市3—7月海水溫度變化分析黏管藻配子體的溫度性質(zhì)。3—6月, 海水溫度從5.9℃升至15.3℃, 這段時間黏管藻配子體逐漸生長,其中5—6月藻體生長速度最快, 平均生物量迅速增大, 海水溫度范圍為10.6—15.3℃。6—7月, 海水溫度從15.3℃ 升至20.7℃, 黏管藻配子體逐漸減少,8月至次年2月未采集到黏管藻配子體。綜上所述,黏管藻配子體的適宜生長溫度在10.6—15.3℃, 故黏管藻配子體的溫度性質(zhì)屬于溫帶性。

表 3 不同采集點的黏管藻配子體外部形態(tài)的比較Tab. 3 The morphological characteristics of G. capillaris gametophyte from different localities

2.5 rbcL和COⅠ基因序列分析

rbcL基因序列分析本研究從6個地點各獲得2條總共12條黏管藻的rbcL序列并提交到Gen-Bank中, 所獲得登錄號為： MG645982、MG645983、MG645984、MG645985、MG645986、MG645987、MG645988、MG645989、MG645990、MG645991、MG645992和MG645993。共比對17條序列, 對比矯正后序列矩陣長度為1226 bp?；贛L法、NJ法和MP法構(gòu)建了rbcL序列的系統(tǒng)發(fā)育樹, 3種方法所構(gòu)建的發(fā)育樹具有相似的拓撲結(jié)構(gòu), 故以ML法所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)顯示。結(jié)果如圖 5所示, 本研究的12個樣本之間無堿基差異, 與產(chǎn)自加拿大的黏管藻在系統(tǒng)樹中聚在一個分支中, 無堿基差異, 確定為黏管藻。與黏管藻屬的輪生黏管藻堿基差異為64 bp (7.97%)。與黏管藻科Plagiospora屬的P. gracilis堿基差異為157 bp (12.56%)。與外群種亮管藻屬的亮管藻堿基差異為170 bp (13.07%)以及與Schimmelmannia屬的S. plumosa堿基差異為185 bp (12.83%)。

COⅠ基因序列分析本研究從6個地點各獲得2條總共12條黏管藻的COⅠ序列并提交到GenBank中, 所獲得登錄號為： MG645994、MG 645995、MG645996、MG645997、MG645998、MG645999、MG646000、MG646001、MG646002、MG646003、MG646004和MG646005。共比對15條序列, 對比矯正后序列矩陣長度為664 bp?；贛L法、NJ法和MP法構(gòu)建了COⅠ序列的系統(tǒng)發(fā)育樹, 3種方法所構(gòu)建的發(fā)育樹具有相似的拓撲結(jié)構(gòu), 故以ML法所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)顯示。結(jié)果如圖 6所示, 本研究的12個樣本之間無堿基差異。而與黏管藻屬的輪生黏管藻堿基差異為44 bp (6.35%), 與外群種亮管藻屬的亮管藻堿基差異為109 bp (8.83%), 與Schimmelmannia屬的S.plumosa堿基差異為110 bp (8.98%)。

圖 3 黏管藻配子體個體形態(tài)的變化Fig. 3 Different morphology of G. capillaris gametophyte at different stages

3 討論

圖 4 黏管藻配子體營養(yǎng)結(jié)構(gòu)與生殖結(jié)構(gòu)Fig. 4 The vegetative structure and reproductive structure of G. capillaris gametophyte

采自大連6個地點的黏管藻樣本的外部形態(tài)、營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和生殖結(jié)構(gòu)與夏邦美[1]和曾呈奎[5]的描述一致。在外部形態(tài)上, 本研究的樣本具有較密的次生分枝, 而輪生黏管藻(G. verticillaris)具有3—6個漸細的輪生分枝, 無次生分枝, 二者易于區(qū)分。因此從形態(tài)學(xué)上確定本研究的樣本是黏管藻。根據(jù)rbcL序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 5)顯示, 本研究中的12個樣本與產(chǎn)自加拿大的黏管藻聚在一起, 形成一個獨立的分支, 自展值為100, 區(qū)別于其他種,驗證了本研究的12個樣本為黏管藻。根據(jù)COⅠ序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 6)顯示, 本研究的12個樣本間聚在一起, 形成一個獨立的分支, 自展值為99, 與同屬的輪生黏管藻(G. verticillaris)堿基差異為44 bp (6.352%), 并與該種形成一個較大的黏管藻屬分支, Le Gall等[18]研究了DNA條形碼技術(shù)對于研究海藻種類多樣性的作用, 認為海藻堿基序列差異大于2%屬于種間差異, 驗證了本研究的12個樣本為黏管藻。

圖 5 基于rbcL序列所構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 The Maximum likelihood (ML) tree was based on rbcL sequences

表 4 黏管藻配子體生物量的變化Tab. 4 The biomass of G. capillaris gametophyte

Newton[19]對分布于歐洲的黏管藻配子體的生長周期進行了調(diào)查, 發(fā)現(xiàn)其春天和夏天有分布, 這與我們的調(diào)查結(jié)果一致。由于黏管藻的四分孢子體為殼狀, 故很難確定黏管藻四分孢子體的生長周期及溫度性質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)大連獐子島與海洋島的黏管藻配子體在外部形態(tài)與平均生物量上明顯大于其他采集地點。經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)獐子島與海洋島遠離內(nèi)陸, 海洋生態(tài)環(huán)境保護較好, 海水富營養(yǎng)化程度較低, 所以我們推測黏管藻的生長對于環(huán)境條件要求較高, 對N、P等營養(yǎng)鹽及重金屬耐受力較弱, 可作為指示植物在海洋水體污染的監(jiān)測中起到重要作用。王永宇等[14]通過對單條膠黏藻(Dumontia simplex)的生長狀態(tài)進行了研究, 發(fā)現(xiàn)在海水富營養(yǎng)化嚴重的海域其外部形態(tài)和生物量更大,這說明海水富營養(yǎng)化對不同藻類的生長狀態(tài)影響不同。筆者在標(biāo)本采集時發(fā)現(xiàn)大連海域近幾年黏管藻的分布范圍逐漸減小, 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象與大連海域近幾年5—6月份石莼(U. lactuca)的大量繁殖有關(guān)。海水富營養(yǎng)化為石莼的大量繁殖提供有利的條件[20], 此時正是黏管藻的繁殖盛期, 生長受到抑制的黏管藻與大量繁殖的石莼相互競爭處于弱勢, 黏管藻的生活空間被侵占, 最終使其分布范圍逐漸減小, 因此有必要對該種繼續(xù)跟蹤調(diào)查。此外, 筆者發(fā)現(xiàn)大連海域一些常見海藻如刺松藻(Codium fragile)、海蘿(Gloiopeltis furcate)等由于海洋生態(tài)環(huán)境的惡化其分布范圍也變得越來越小。據(jù)統(tǒng)計大連地區(qū)海洋中蘊藏的海藻有71種海藻屬于藥用海藻[21], 具有抗凝血、抗氧化等多種生物活性[22—24]。因此有必要對大連地區(qū)海藻物種以及海洋生態(tài)環(huán)境進行保護來實現(xiàn)海洋環(huán)境和海洋經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。

表 5 黏管藻配子體成熟個體比例變化Tab. 5 The mature individual proportion of G. capillaris gametophyte

表 6 黏管藻配子體R/T指數(shù)的變化Tab. 6 The R/T ratio of G. capillaris gametophyte

圖 6 基于COⅠ序列所構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 The Maximum likelihood (ML) tree based on the COⅠ sequences

本研究明確了分布在大連沿海的黏管藻及其資源現(xiàn)狀, 明確了其生長周期與繁殖盛期并分析了該種分布減少的原因, 為該種的保護、繁育提供詳細的數(shù)據(jù)支撐并推測黏管藻可作為指示植物在海洋水體污染的監(jiān)測中具有重要的作用, 為分布于全國其他海域的黏管藻的研究提供參考。