松潘裸鯉仔稚魚耳石生長輪日周期確證及其孵化期推算

嚴(yán)太明 張松培 何 亮 羅 杰 何 智

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 成都 611130)

魚類耳石微結(jié)構(gòu)特征具有種屬特異性[1,2], 通過建立耳石微結(jié)構(gòu)特征與早期生活史事件的對應(yīng)關(guān)系, 可以利用耳石微結(jié)構(gòu)分析反映魚類個體的早期生長發(fā)育狀況及其與生活環(huán)境的關(guān)系[3,4]。基于耳石微結(jié)構(gòu)特征而建立的耳石日輪技術(shù)已廣泛應(yīng)用于魚類早期生活史研究、產(chǎn)卵場位置和產(chǎn)卵期的推算等[5—8]。

松潘裸鯉(Gymnocypris potanini)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裸鯉屬(Gymnocypris)[9], 是分布于岷江上游和瀾滄江水系的一種小型裂腹魚類, 主要生活在常年低溫的山區(qū)河流, 研究也證實在其人工養(yǎng)殖條件下胚胎發(fā)育的孵化溫度和幼魚飼養(yǎng)水溫不宜超過23℃[11—13]。受水電水利工程的興建和捕撈強度增大的影響, 松潘裸鯉生境大幅壓縮, 資源量銳減, 物種生存受到嚴(yán)重威脅[10]。目前, 有關(guān)其耳石微結(jié)構(gòu)特征等的報道僅見Song等[11]對采自岷江支流雜谷腦河古爾溝段的松潘裸鯉幼魚樣本的分析結(jié)果： 在采集的120尾樣本中, 絕大多數(shù)微耳石和矢耳石具有多個原基, 且矢耳石的論文清晰度高于微耳石, 基于耳石輪紋數(shù)推測這些樣本的日齡在14—22d, 孵化期日期為6月中下旬。本文采用COⅠ序列輔助鑒定物種, 對2015年和2016年野外采集的松潘裸鯉仔稚魚的耳石形態(tài)變化、輪紋沉積規(guī)律等耳石微結(jié)構(gòu)特征進行了分析, 并利用耳石日輪技術(shù)推算了其在野外的孵化期, 旨在為松潘裸鯉的資源保護提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗樣本來自2015年8月5日在四川理縣雜谷腦河(岷江上游一級支流)支流孟屯河上游河段(N：31°43′57.82″, E： 103°2′11.37″)用20目圍網(wǎng)捕獲的魚類仔稚魚。在樣本帶回實驗室后, 部分置于白色塑料盆(36.0 cm×28.0 cm×12.0 cm)內(nèi)飼養(yǎng)用于輪紋沉積規(guī)律確證, 部分樣本直接用無水乙醇固定。固定樣本在顯微鏡下挑取微耳石和矢耳石, 無水乙醇清洗后用中性樹膠固定于載玻片上用于耳石微結(jié)構(gòu)特征分析。在顯微鏡下統(tǒng)計微耳石和矢耳石輪紋數(shù), 用Olympus CKX41照相系統(tǒng)對耳石樣本形態(tài)進行觀察并拍照, 以及測量微耳石和矢耳石輪紋寬度(測量起點為耳石原基邊緣位置)。

為進一步確定其仔魚孵出時間, 2016年9月10日再次在2015年樣品采集地用同樣的方式采集仔稚魚。捕獲的松潘裸鯉仔稚魚直接用無水乙醇固定, 在室內(nèi)進行耳石樣本的挑取和分析。

1.2 仔稚魚物種確證

根據(jù)《四川魚類志》和《中國動物志硬骨魚綱鯉形目(下卷)》等資料, 結(jié)合實地走訪, 初步判斷采集的仔稚魚隸屬于裂腹魚亞科魚類。為進一步準(zhǔn)確判斷其種屬, 采用線粒體細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ(Cytochrome oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)引物(COⅠF： TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC;COⅠR： TAGACTTCTGGTGGCCAAAGAATCA)進行PCR擴增獲取其COⅠ序列, 并利用Clustal X 1.81和MEGA 8.0軟件對序列進行同源比對, 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹輔助鑒定物種。

1.3 耳石輪紋特征研究

采用溫度標(biāo)記法[12](12—18℃)對仔稚魚耳石輪紋進行標(biāo)記, 以24h (12h高溫—12h低溫)為一個周期, 間隔1天取樣1次。具體操作為： 9：00—21：00置放于溫度為(18.0±0.5)℃的生化培養(yǎng)箱中培育,21：00—9：00置放于溫度為(12.0±1.0)℃的生化培養(yǎng)箱培育。在進行溫度標(biāo)記實驗前, 將實驗魚恒溫(20.0±1.0)℃培養(yǎng)24h, 以確定標(biāo)記起點。實驗期間分別于8：00和18：00換水之前30min投喂消毒搗碎后的水蚯蚓, 并換等溫曝氣的自來水。

實驗魚用鹽酸利多卡因(濃度為30 mg/L)麻醉并斷頭后, 在顯微鏡下挑取微耳石和矢耳石, 無水乙醇清洗后用中性樹膠固定于載玻片上, 并統(tǒng)計微耳石和矢耳石輪紋數(shù)。

1.4 繁殖期推算

參照裂腹魚等魚類的日齡可用日輪數(shù)N+1表示的方法[13,14], 結(jié)合本研究確定的耳石輪紋沉積的周期性規(guī)律, 通過采樣日期和微耳石日輪數(shù)推算仔稚魚孵化期。

1.5 數(shù)據(jù)和圖片處理

2 結(jié)果

2.1 仔稚魚物種確定

隨機選取的10個樣本經(jīng)過PCR擴增和測序獲得片段大小為700 bp的10條序列(GenBank ID：MK716222—MK716231)。裸鯉屬魚類的COⅠ系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果表明, 所獲得序列與裸鯉屬幾個物種聚在一起形成單系(圖 1), 且與GenBank中松潘裸鯉共享同一個單倍型。因此, 可以確定所采集仔稚魚為松潘裸鯉(Gymnocypris potanini)。

2.2 輪紋沉積周期規(guī)律確證

輪紋數(shù)統(tǒng)計結(jié)果表明, 仔稚魚恒溫培養(yǎng)24h出現(xiàn)較寬的1輪標(biāo)記輪, 之后每標(biāo)記2天形成2個標(biāo)記輪。溫度標(biāo)記處理后的耳石輪紋界限較未溫度標(biāo)記處理更清晰, 輪紋寬度均勻(圖 2A和2B)。微耳石標(biāo)記輪紋數(shù)量(Increment number of lapilli,I)與輪紋標(biāo)記時間(Days,D)呈線性相關(guān), 回歸方程為：I=1.0065D-0.0643 (R2=0.9921,n=41, 圖 2C), 方程斜率與1差異不顯著(P＞0.05), 這表明松潘裸鯉輪紋沉積具有日周期性, 生長輪為日輪。

2.3 日齡構(gòu)成與孵化期推算

統(tǒng)計結(jié)果表明, 2015年松潘裸鯉樣本微耳石(n=45)輪紋數(shù)范圍為34—46輪, 其中比例最高的為41輪和43輪, 均占總數(shù)的13.33%, 其次為42輪, 占總數(shù)的11.11% (圖 3A)。矢耳石(n=41)輪紋數(shù)范圍為34—46輪, 其中比例最高的37輪, 占總數(shù)的14.63%,其次為34輪和41輪, 均占總數(shù)的12.20% (圖 3B)。

松潘裸鯉孵化期依據(jù)日齡為日輪數(shù)N+1的關(guān)系式進行推算。統(tǒng)計結(jié)果表明, 2015年的45個樣本的出膜時間為6月29日至7月15日, 歷時14d。出膜高峰期在7月2日至7月12日, 其中7月9日出膜仔魚數(shù)量最多, 占樣本量的14.63% (圖 4A)。

2016年的328個樣本孵化期為7月13日至8月18日, 歷時37d。出膜高峰期7月27日至8月13日, 其中8月3日出膜個體數(shù)量最多, 占樣本量的6.71%; 其次為8月2日和8月6日, 占樣本量的6.40% (圖 4B)。

2.4 耳石形態(tài)變化和輪紋寬度

微耳石形態(tài)變化隨著輪紋數(shù)的增加相對穩(wěn)定。輪紋數(shù)為34的微耳石近圓形, 背區(qū)平直, 腹區(qū)呈圓弧狀(圖 5A); 輪紋數(shù)為40的微耳石呈貽貝形,背區(qū)微凹(圖 5B), 而背區(qū)凹入明顯則出現(xiàn)在輪紋數(shù)為46輪的微耳石中(圖 5C)。

與微耳石相比, 矢耳石形態(tài)變化明顯。輪紋數(shù)為34輪的矢耳石呈楔形, 后端基葉呈尖狀突起(圖 5D);40輪矢耳石基葉突出明顯, 前端有向背側(cè)方向彎曲的趨勢, 后端向腹側(cè)方向彎曲并向后延伸, 略鈍圓(圖 5E); 46輪的矢耳石呈明顯的箭矢狀： 前端鈍圓,后端細長光滑并有明顯的嵴, 并與腹區(qū)形成小凹,背區(qū)較平直(圖 5F)。

圖 2 松潘裸鯉仔稚魚微耳石標(biāo)記輪紋數(shù)量(A和B)及輪紋數(shù)和標(biāo)記時間的關(guān)系(C)Fig. 2 The characteristics of the marked increment and the relationship between time and the number of increment of lapilli in Gymnocypris potanini larvae

圖 3 2015年樣本微耳石(A)和矢耳石(B)輪紋數(shù)Fig. 3 Increment number of Lapillus and Sagitta

圖 4 2015年(A)和2016年(B)松潘裸鯉仔稚魚孵化期Fig. 4 Hatching-date distributions of Gymnocypris potanini larvae in 2015 (A) and 2016 (B)

圖 5 松潘裸鯉仔稚魚微耳石和矢耳石形態(tài)發(fā)育Fig. 5 Otolith development in Gymnocypris potanini larvae

圖 6 松潘裸鯉微耳石(A)和矢耳石(B)輪紋寬度變化Fig. 6 Trajectory of the increments width of lapilli (A) and sagittae (B) in Gymnocypris potanini larvae and juvenile

輪紋寬度分析結(jié)果表明, 仔稚魚微耳石(n=44)和矢耳石(n=33)的輪紋寬度隨著日齡的增加均有增大的趨勢(圖 6)。微耳石變化為(1.29±0.77)—(2.68±1.03) μm; 矢耳石變化為(1.42±0.50)—(4.82±1.80) μm。其中, 微耳石輪紋寬度最小為第6輪, 最大第30輪,而矢耳石最小為第11輪, 最大第39輪。

3 討論

基于耳石微結(jié)構(gòu)特征而建立的耳石日輪技術(shù)在應(yīng)用于魚類早期生活史、孵化期或產(chǎn)卵期、個體發(fā)育情況和魚苗種群等的研究之前, 需對其耳石微結(jié)構(gòu)特征進行評估。魚類耳石上第一條輪紋形成時間是利用耳石研究魚類日齡等早期生活史的前提, 通過結(jié)合耳石初始日輪的出現(xiàn)時間及輪紋沉積規(guī)律, 并結(jié)合耳石輪紋數(shù)建立的耳石日輪技術(shù)可對魚類的日齡或孵化期進行推算[15,16]。相關(guān)研究證實, 耳石第一輪紋的形成具有物種特異性, 且和環(huán)境條件、個體發(fā)育等息息相關(guān)[17,18]。在本研究中, 采集到的仔魚已出膜, 不能判斷第一輪紋出現(xiàn)的具體時間, 故參照裂腹魚亞科的齊口裂腹魚(Schizothorax prenonti)和骨唇黃河魚(Chuanchia labiosa)等的研究結(jié)果[13,14], 推測其第一輪紋出現(xiàn)時間為出膜后第二天。此外, 雖然大多魚類耳石輪紋沉積具有日周期性, 但沉積規(guī)律作為耳石日輪技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵參數(shù), 對孵化期推算的正確性起著決定性作用, 故最好能在應(yīng)用前對其沉積規(guī)律進行有效評估[19,20]。因此, 本文采用溫度標(biāo)記法確證了松潘裸鯉仔稚魚的耳石輪紋沉積具有日周期性。這與裂腹魚亞科的齊口裂腹魚和骨唇黃河魚等的研究結(jié)果類似[13,14]。綜上, 松潘裸鯉的日齡(D)仍可用日輪數(shù)(N)+1表示。

魚類3對耳石上均有輪紋存在, 但出現(xiàn)時間和清晰度等存在較大差異[21]。由于星耳石輪紋出現(xiàn)晚且不清晰等的限制[22], 耳石日輪技術(shù)中日齡的鑒定往往采用微耳石和矢耳石。研究發(fā)現(xiàn), 三峽水庫太湖新銀魚(Neosalanx taihuensis)和珠江口黃唇魚(Bahaba flavolabiata)等矢耳石的輪紋微結(jié)構(gòu)能較好的滿足其仔稚魚產(chǎn)卵期、生長等方面的分析要求[22—24], 但大多數(shù)淡水魚類, 尤其是鯉科魚類矢耳石易碎, 形態(tài)不規(guī)則且輪紋不易辨別, 如小眼須雅羅魚(Semotilus corporalis)和草魚(Ctenopharyngoolon idellus)等[7,23]。此外, 相較于矢耳石形態(tài)變化,在仔稚魚發(fā)育過程中微耳石形態(tài)總體變化不大, 較適合作為魚類日輪分析的研究材料[13,14,25,26]。Song等[11]的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn), 松潘裸鯉耳石輪紋在13.0—21.5輪時, 矢耳石大多呈圓形、卵圓形或長橢圓形, 微耳石呈圓形或卵圓形, 此時, 矢耳石的輪紋清晰度高于微耳石, 為此采用矢耳石進行輪紋統(tǒng)計較為適宜。而在本研究中, 矢耳石和微耳石輪紋在33—46輪, 矢耳石形態(tài)處于由楔形到箭矢狀的劇烈變化過程中, 這就使得矢耳石挑取過程中易碎且輪紋相對模糊不易識別, 而微耳石在生長過程中變化甚微, 生長輪的清晰度較高, 輪紋易于區(qū)別, 故此時微耳石較適宜作為日輪鑒定材料。綜上, 在進行松潘裸鯉日輪統(tǒng)計時, 早期稚魚建議以矢耳石為材料, 后期稚魚最好采用微耳石為鑒定材料。

本文從雜谷腦河支流孟屯河采集的松潘裸鯉仔稚魚微耳石[(1.29±0.77)—(2.68±1.0)3 μm]和矢耳石[(1.42±0.50)—(4.82±1.80) μm]輪紋寬度較Song等[11]從雜谷腦河干流采集樣本的耳石輪紋寬度窄[微耳石(4.25±0.427) μm和矢耳石(5.44±0.409) μm]。孟屯河水流湍急, 溝谷狹窄屬于雜谷腦河的一級支流, 采集地距離匯合口的距離為45.0 km左右, 采集地的水溫低于干流的水溫2.2—2.5℃。由此可推測, 松潘裸鯉仔稚魚耳石輪紋寬度的差異可能與魚類采集地的水溫不同有較大關(guān)系。類似的結(jié)果在白鮭屬魚類也得以證實： 高溫標(biāo)記的耳石輪紋寬度明顯寬于低溫標(biāo)記的耳石輪紋寬度[27]。此外, Song等[11]樣本采集時間在夏季, 而本研究樣本采集時間在秋季, 餌料豐度也可能影響其輪紋寬度的原因之一。

此外, 松潘裸鯉耳石輪紋寬度整體呈先逐漸變窄、后增寬的趨勢。其中, 微耳石輪紋寬度在前6輪下降的趨勢較矢耳石明顯, 后期進入實驗室養(yǎng)殖條件后, 耳石輪紋寬度增寬的趨勢均較明顯, 這種輪紋寬度的變化趨勢與長江口鳳鱭(Coilia mystus)[28]、香魚(Plecoglossus altivelis)[29]和太湖新銀魚(Neosalanx taihuensis)等的研究結(jié)果類似。松潘裸鯉胚后仔魚的研究結(jié)果表明, 出膜后第6天仔魚開始平游和覓食[30], 仔魚的食性轉(zhuǎn)變恰好與耳石輪紋寬度變窄相吻合。

本研究基于耳石日輪技術(shù)[31,32]推算出, 孟屯河上游2015年采集的仔稚魚樣本的孵化時間為6月29日至7月15日, 2016年樣本的孵化時間為7月13日至8月18日, 晚于干流雜谷腦河捕獲的仔稚魚的孵化期6月17—25日[11]。吳青等[30]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 松潘裸鯉胚胎在(17±2)℃和11—17℃流水環(huán)境中歷時204h和248h出膜。綜上可知, 雜谷腦河流域松潘裸鯉的產(chǎn)卵時間可能開始于6月初, 產(chǎn)卵活動會一直持續(xù)2個月左右。因此, 6—8月是雜谷腦河干支流松潘裸鯉產(chǎn)卵繁殖的重要時段, 故在此期間應(yīng)做好產(chǎn)卵群體魚類的保護工作, 以保證其野生資源得以較好的補充。