消腫止痛顆粒對大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中NF-κB和ICAM-1表達的影響*

王守朝，陳興濤，劉 濤 ，宋 淵，謝春華

(1.金昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 ，甘肅 金昌 737100； 2.甘肅省中醫(yī)院， 甘肅 蘭州 730050)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)主要以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)積液、功能障礙，以及晚期的關(guān)節(jié)變形等為臨床表現(xiàn)[1]。KOA的發(fā)病機制尚不明確，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為風(fēng)寒濕邪阻滯、經(jīng)絡(luò)不通、肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)是該病的基本病機[2]；西醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病與年齡、性別、遺傳、肥胖、急性損傷和慢性勞損等因素有關(guān)，主要以關(guān)節(jié)軟骨的退變、軟骨關(guān)節(jié)緣骨贅形成為病理基礎(chǔ)，從而引起滑膜、關(guān)節(jié)囊和軟組織的損傷和炎癥反應(yīng)[3]。不管是中醫(yī)學(xué)還是發(fā)展迅速的西醫(yī)學(xué)，對KOA的治療都有自己獨到的優(yōu)勢。本實驗通過觀察消腫止痛顆粒對改良Hulth法膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)學(xué)改變、NF-κB mRNA及ICAM-1 mRNA表達情況的影響，以期為消腫止痛顆粒在治療KOA方面的臨床運用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

10月齡SPF級健康Wistar 大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20)g，生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘)2015-0035，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。安靜狀態(tài)下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飲水、飼料充足，光照周期12L/12D(7：00-19：00)，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±10)%。

1.2 藥品、試劑與儀器

消腫止痛顆粒處方組成：當(dāng)歸、生地黃、川芎、白芍、桃仁、紅花、三七、青皮、木香、澤蘭、獨活、秦艽。藥液由甘肅省中醫(yī)院制劑科生產(chǎn)，批號20051122。硫酸氨基葡萄糖片，0.314 g/片，新興同仁藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號16030；注射用青霉素鈉，400萬單位/支，華北制藥股份有限公司產(chǎn)品， 批號S1207502。PrimeScript TM RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號DRR037)、SYBR? Premix Ex Taq TM實時定量PCR試劑盒(批號RR820A)，均為寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品； E.Z.N.A. Total RNA KitⅠ，美國Omega公司產(chǎn)口，批號R6834-01；PBS緩沖液，北京藍博斯特生物科技有限公司產(chǎn)品，批號NYJ0985；TRIZOL試劑， Invitrogen 公司產(chǎn)品，批號16105；瓊脂糖，上海川翔生物科技有限公司產(chǎn)品，批號0000101527；EDTA緩沖液，上海西唐生物科技有限公司產(chǎn)品，批號000152532。熱電88400V60型-80 ℃超低溫冰箱，美國 Thermo 公司產(chǎn)品；OLYMPUSCH光學(xué)顯微鏡，產(chǎn)地日本；CT14RD型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；S1000型PCR熱循環(huán)儀、熒光定量PCR儀，均為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品 。

1.3 動物分組與模型的建立

將大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型對照組、硫酸氨基葡萄糖片組、消腫止痛顆粒組4組，每組20只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。1周后，按照文獻[4]方法造模。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 g/L 的水合氯醛按3.5 μL/體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，固定于手術(shù)臺上，選取左后側(cè)膝關(guān)節(jié)為手術(shù)區(qū)域，常規(guī)備皮，消毒,取髕旁內(nèi)側(cè)縱切口(切口長約1.2 cm)。假手術(shù)組僅切開皮膚，然后直接縫合。其余各大組采用改良Hulth法造模：用小尖刀片逐層依次切開皮膚、筋膜，打開關(guān)節(jié)腔，拿鑷子將髕骨向外側(cè)推至脫位，屈曲膝關(guān)節(jié)，暴露前交叉、內(nèi)側(cè)副韌帶，先切斷前交叉、內(nèi)側(cè)副韌帶，再摘除內(nèi)側(cè)半月板，保護好周圍其他組織，無菌紗布按壓止血、以生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔并逐層縫合，不包扎。術(shù)后每只大鼠給予40萬單位青霉素臀大肌肌內(nèi)注射，連續(xù)7 d。造模后大鼠全部存活，手術(shù)傷口未見紅腫、滲出，術(shù)后8～10 d基本愈合。傷口愈合后每日驅(qū)趕大鼠活動 0.5 h，驅(qū)趕8周后KOA造模成功。

1.4 給藥方法

按照《中藥藥理研究方法學(xué)》[5]中的方法，根據(jù)人和大鼠的計量折算系數(shù)確定給藥量。消腫止痛顆粒組大鼠的劑量約為7 μg/(g·d)，給予消腫止痛顆粒1.87 μL/(g·d)灌胃；硫酸氨基葡萄糖片組給予硫酸氨基葡萄糖片170 μg/(g·d)灌胃；模型對照組給予等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9 g/L的生理鹽水灌胃；假手術(shù)組自由飲水。共灌胃8周。

1.5 檢測指標(biāo)

灌胃結(jié)束，處死大鼠并取樣。

1.5.1 關(guān)節(jié)軟骨的肉眼大體形態(tài)觀察

按照文獻[6]方法進行。在光線充足的條件下，逐層切開大鼠左后側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚、筋膜、關(guān)節(jié)囊，充分暴露膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨表面破壞程度、光澤及顏色等。

1.5.2 關(guān)節(jié)軟骨光鏡觀察

按照文獻[7]方法進行。取右后肢內(nèi)側(cè)股骨髁關(guān)節(jié)面軟骨，沖洗干凈后放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定，固定2 d，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 150 g/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA)脫鈣液中進行脫鈣處理。每周更換1次EDTA脫鈣液。脫鈣4周后，石蠟包埋(包埋時注意控制溫度和切面完整)，切片，HE染色，在100倍光鏡下觀察。按照Mankins標(biāo)準(zhǔn)對HE染色進行評分[8]。

1.5.3 RT-PCR法檢測各組軟骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA的表達

按照文獻[9]方法進行。

總RNA提?。簩㈩A(yù)先凍存的軟骨組織從液氮罐中取出，取50 mg軟骨組織，DEPC水沖洗，搗碎置于350 μL的組織裂解液(TRIZOL)內(nèi)，用微量組織勻漿器行勻漿處理，勻漿后加650 μL TRIZOL。裂解完成后加入0.2 mL的氯仿，管蓋蓋緊后顛倒混勻15 s。冰上靜置20 min，會看到氯仿和TRIZOL已經(jīng)分離為上、下兩層，但氯仿層比較混濁，輕輕放入4 ℃ 離心機，離心10 min；離心后，會看到明顯的分層，其中上清液中含有RNA。吸取上清(切勿將中、下層吸進)，按照吸取的上清容積加入異丙醇(異丙醇與上清液的比例為1∶1)，混勻，靜止10 min后再次離心10 min。離心后，底層出現(xiàn)乳白色的固體沉著，倒掉上清液，加體積分?jǐn)?shù)750 mL /L的酒精(預(yù)冷)，吹打，離心2 min。倒掉上清液，加體積分?jǐn)?shù)750 ml /L的酒精(預(yù)冷)，吹打，離心2 min。自然干燥10 min，加入20 μL的DEPC水，吹打，混勻，即得總RNA。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：提取總RNA后，采用頸環(huán)結(jié)構(gòu)的MegaPlexTMRNA反轉(zhuǎn)錄引物混合物進行反轉(zhuǎn)錄，按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄說明書PrimeSciptTMRT Waster MIX 操作進行逆轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系如下：PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s,75 ℃延伸30 s，75 ℃終極延伸1 min，共40個循環(huán)。觀察擴增曲線和溶解曲線，溶解曲線以單峰為佳。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)體系見表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)設(shè)置：在 PCR 儀上，16 ℃，10 min； 37 ℃，30 min；65 ℃，5 min。

表1 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)體系

實時定量熒光PCR：反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后按照RT-PCR反應(yīng)體系進行擴增，以GAPDH作為內(nèi)參對照，進行PCR產(chǎn)物的半定量分析，引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s,75 ℃延伸30 s，75 ℃終極延伸1 min，共40個循環(huán)。觀察擴增曲線和溶解曲線，RT-PCR結(jié)果采用相對定量2-ΔΔCt法計算表達量。PCR反應(yīng)體系見表3。

表2 引物序列

表3 PCR反應(yīng)體系

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的大體形態(tài)觀察

假手術(shù)組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨面光滑、透明，色澤如常，關(guān)節(jié)面完整、無裂隙、無潰瘍，關(guān)節(jié)表面無明顯變化。模型對照組大鼠的關(guān)節(jié)表面粗糙不平，色澤灰暗，軟骨透明度明顯降低，有不同程度軟骨糜爛、潰瘍形成，甚至出現(xiàn)剝脫、缺損、軟骨下骨質(zhì)暴露現(xiàn)象。兩個藥物組大鼠的軟骨透明度、色澤較模型對照組明顯改善，軟骨表面粗糙，整體情況較假手術(shù)組略差，個別區(qū)域顏色偏暗。

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨光鏡觀察

假手術(shù)組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，染色清晰，軟骨表層、軟骨移行層、輻射層和鈣化層清楚可辨，細胞排列整齊，層次清晰，染色質(zhì)分布均勻，細胞核清晰。模型對照組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，表層變薄甚至消失，部分區(qū)域有絨毛狀表現(xiàn)，裂隙較多可達深層，部分區(qū)域的細胞核固縮、壞死，鈣化層細胞紊亂排列呈簇狀，潮線不完整或消失。兩個藥物組大鼠的軟骨組織損傷程度好于模型對照組,但比假手術(shù)組損傷程度嚴(yán)重：不規(guī)則排列的軟骨細胞在部分區(qū)域仍可見，但較模型對照組少見，各層界限仍欠清楚，鏡下個別區(qū)域存在簇集現(xiàn)象,基質(zhì)染色較均勻，個別潮線不完整。各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨HE染色光鏡下病理切片見圖1，Mankins評分對比見表4。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨光鏡下病理切片(HE，×100)

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankins評分對比 分，

注：與假手術(shù)組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.3 各組關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表達對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表達明顯升高(P<0.05)。與模型對照組對比，消腫止痛顆粒組、硫酸氨基葡萄糖片組關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表達明顯降低(P<0.05)。與硫酸氨基葡萄糖片組對比，消腫止痛顆粒組NF-κB、ICAM-1 mRNA表達差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表達對比

注：與假手術(shù)組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0. 05；與硫酸氨基葡萄糖片組對比，△P<0. 05。

3 討 論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種慢性、進行性的關(guān)節(jié)軟骨退行性疾病。X線片表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙變窄，關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)硬化，以及部分或大量骨贅形成。臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，腫脹，僵硬感，由疼痛引起的活動受限、關(guān)節(jié)畸形等。與軟骨相關(guān)的軟骨細胞、細胞外基質(zhì)和軟骨下骨三者間合成和分解代謝失衡[10]是KOA發(fā)病的關(guān)鍵，力學(xué)和生物學(xué)因素的共同作用是其發(fā)病的主要根源。正常人軟骨的合成和分解處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但KOA患者關(guān)節(jié)軟骨的代謝處于負平衡，即分解大于合成，平衡失調(diào)破壞了患者的關(guān)節(jié)軟骨[11]，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞，軟骨下骨發(fā)生硬化，關(guān)節(jié)周緣骨質(zhì)增生，滑膜肥厚增生，關(guān)節(jié)囊攣縮及肌肉萎縮等[12]。KOA的發(fā)病率隨著年齡的增長而增長，女性較男性多見。來自流行病學(xué)的調(diào)查顯示：60歲以上的人群中，約50%的人在X線片上可看到KOA表現(xiàn)，35%～50%有臨床表現(xiàn)；75歲以上的人群中，80%有KOA癥狀[13]。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示：超過50歲的人群中，KOA導(dǎo)致長期殘疾的幾率僅次于排在第一位的心血管疾病。該病有高達53%的致殘率，給社會和家庭造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[14]。因此，探索一種符合我國國情、行之有效的治療方法勢在必行。

NF-κB通路在炎癥因子的表達中起關(guān)鍵作用。在未受刺激的情況下，NF-κB二聚體被κBs抑制劑(IκB)隔離在細胞質(zhì)中，通過用IκB的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域掩蓋NF-κB蛋白的核定位信號而將NF-κB蛋白保留在細胞質(zhì)中[14]。激活后，IκB被磷酸化，導(dǎo)致靶向蛋白酶體降解并釋放NF-κB蛋白。隨后，NF-κB蛋白被移入細胞核并開啟其啟動子或其他位點中具有NK-κB結(jié)合元件的特定基因的表達[16]。激活I(lǐng)κB激酶(IKKs)以響應(yīng)幾個信號使IκB蛋白磷酸化并引起它們的降解，這使得游離的NF-κB復(fù)合物從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中并引發(fā)靶基因反式激活[17]。 NF-κB信號通過各種作用廣泛參與骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)的病理生理過程，并在衰老和炎癥過程中在OA軟骨細胞中被激活[18]。 NF-κB通路對于誘導(dǎo)各種炎癥相關(guān)因子至關(guān)重要，包括Mmp蛋白，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，IL-1β和TNF-α，這些誘導(dǎo)的細胞因子進一步激活信號級聯(lián)反應(yīng)。ICAM-1是介導(dǎo)OA發(fā)病過程中單核細胞粘附和浸潤的重要粘附分子。ICAM-1是一種誘導(dǎo)型表面糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，可介導(dǎo)粘附依賴性細胞間相互作用[19]。 ICAM-1的胞外結(jié)構(gòu)域在白細胞從血管遷移到炎癥部位的過程中起著至關(guān)重要的作用。在OA患者的滑膜中已顯示出ICAM-1的上調(diào)，這可能是白細胞募集到滑膜組織中的重要調(diào)節(jié)因子。 此外，通過降低關(guān)節(jié)液中ICAM-1的水平能夠抑制OA的炎癥反應(yīng)和改疼痛癥狀。研究還發(fā)現(xiàn)，ICAM-1基因啟動子上含有NF-κB結(jié)合位點[20]。在OA的形成和發(fā)展中，NF-κB還作為關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控ICAM-1的轉(zhuǎn)錄與表達，使ICAM-1表達增多，吸引單核巨噬細胞、淋巴細胞的侵入和聚集，加重局部的炎癥反應(yīng)和炎癥損傷。

骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇。骨痹首出于《素問·痹論篇》，指氣血不足或虧虛、風(fēng)寒濕之邪傷于髓骨而表現(xiàn)出的病癥?！端貑枴らL刺節(jié)論篇》云：“病在骨，骨重不可舉、骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！敝赋龉潜缘闹饕R床癥狀是骨骼酸痛，身體困重，四肢沉重不易舉。骨痹的病位在骨，與五臟關(guān)系密切，主要與肝臟、脾臟、腎臟相關(guān)，可涉及筋骨、關(guān)節(jié)、肌肉。中醫(yī)認(rèn)為骨痹與“虛”“邪”“瘀”關(guān)系密切。腎主骨生髓、肝主筋、脾主肌肉。人到中年后，會逐漸出現(xiàn)肝腎虧虛、骨節(jié)失養(yǎng)，又因膝關(guān)節(jié)長期勞損，骨不生髓，髓失骨養(yǎng)，復(fù)加瘀阻、風(fēng)寒濕邪侵襲，遂致經(jīng)絡(luò)不暢、氣血不通故而發(fā)病。本虛標(biāo)實是KOA的主要病機特點。消腫止痛顆粒的主要作用是補腎強筋、活血通絡(luò)，由當(dāng)歸、生地黃、川芎、白芍、桃仁、紅花、三七、青皮、木香、澤蘭、獨活、秦艽組成，可祛風(fēng)除濕、活血止痛，主要用于治療肝腎虧虛、筋脈瘀滯型的骨痹之病。當(dāng)歸、川芎活血祛瘀，消腫止痛；桃仁、紅花加強當(dāng)歸、川芎破瘀血、生新血之力；三七加強行瘀、鎮(zhèn)痛、消腫功效；青皮、木香行氣散結(jié)止痛；生地黃、白芍涼血消瘀；澤蘭消散癰腫，減少滲出，促使腫脹消退。諸藥合用，共奏活血化瘀、消腫止痛之效。 綜上所述,消腫止痛顆?？赏ㄟ^降低NF-κB、ICAM-1mRNA含量表達，保護KOA關(guān)節(jié)軟骨的病理改變，從而減輕關(guān)節(jié)損傷，保護關(guān)節(jié)軟骨，延緩KOA病情的進展。