補(bǔ)腎填精方對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞增值及凋亡的影響*

華杭菊 張麗楓 任麗萍 盧麗莎 鄭 艷 陳武進(jìn)

肺癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)，因氣候環(huán)境變化及飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率及死亡率逐年上升，根據(jù)2017年國(guó)家癌癥中心的數(shù)據(jù)顯示，肺癌是目前致死原因第一的惡性腫瘤，是男性常見(jiàn)腫瘤發(fā)病率第一位[1]。雖然目前腫瘤治療手段越來(lái)越豐富，但其整體預(yù)后仍然很差，5年生存率不足20%[2]。而中藥復(fù)方因其多靶點(diǎn)、多途徑特點(diǎn)，大量研究顯示，復(fù)方中藥特別是補(bǔ)益類(lèi)可改善機(jī)體免疫功能，提高生存質(zhì)量等而廣泛應(yīng)用于臨床?；凇澳I生骨髓”“腎虛致瘤”及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨髓是免疫活動(dòng)細(xì)胞的主要源泉，故中醫(yī)學(xué)腎本質(zhì)與免疫有著密切的關(guān)系。因此，進(jìn)一步探究補(bǔ)腎填精方中藥復(fù)方對(duì) Lewis 肺癌及其T細(xì)胞增殖能力影響，探討補(bǔ)腎填精方改善肺癌細(xì)胞腫瘤免疫微環(huán)境，抑制細(xì)胞增值和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和 Lewis 肺癌細(xì)胞株SD大鼠20只，鼠齡6～8周，雄性，體質(zhì)量(20±2)g；動(dòng)物級(jí)別SPF級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào): SCXK(滬)2017-0003。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房；室溫25℃，濕度70%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng)，小鼠自由采食和飲水。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 U/ml的鏈霉素、pH=7.2)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱保持條件為：37℃、5%CO2及飽和濕度。每隔1天進(jìn)行培養(yǎng)基換液，每3 d傳代1次。

1.1.2 主要試劑及儀器補(bǔ)腎填精方(枸杞子、制何首烏和淫羊藿)按照藥物計(jì)算劑量: 枸杞子30 g,制何首烏30 g和淫羊藿30 g。福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中藥房購(gòu)買(mǎi)，浸泡2 h后，煎煮1 h，二煎8倍量蒸餾水，煎煮1 h，合并煎液，過(guò)濾，濃縮，超速離心后，繼續(xù)濃縮，離心噴霧干燥器制粒。用蒸餾水溶解稀釋至所需濃度。DMEM 購(gòu)自Hyclone公司，胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱香港力康儀器設(shè)備有限公司，CKX41 倒置顯微鏡為日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備SD大鼠共20只，隨機(jī)分為補(bǔ)腎方中藥低、中、高劑量組以及NS對(duì)照組4組。分別為15.75、31.50、63.00 g·kg-1(即按照70 kg體質(zhì)量的成人臨床用量的1倍、2倍、4倍)(并根據(jù)不同種屬間劑量等效折算表?yè)Q算)，水煎煮后，將藥物濃縮至含生藥0.79、1.58、3.16 g·ml藥液大鼠灌胃給藥，每次2 ml灌胃，每日2次給藥；對(duì)照組給予0.9%NS，每日2次,每次2 ml。4組均連續(xù)灌胃給藥5 d，末次給藥結(jié)束后2 h，10%水合氯醛ip麻醉，在無(wú)菌環(huán)境下腹主動(dòng)脈取血，4℃靜置3 h，離心分離血清。將同組血清合并，并置56℃水浴滅活30 min，0.22 μm針頭濾器過(guò)濾除菌，1 ml EP管無(wú)菌分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)制備Lewis肺癌細(xì)胞懸液，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞，予擴(kuò)增第6～8代生長(zhǎng)良好的Lewis肺癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。共分為4組，每組6個(gè)復(fù)孔，1×106個(gè)/孔接種于96孔板中，予含10%胎牛血清的BPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，培養(yǎng)液吸凈，無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液每培養(yǎng)孔加入200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，使Lewis肺癌細(xì)胞同步化。再分別以含10%對(duì)照大鼠血清及低、中、高補(bǔ)腎方含藥血清的RPMI1640培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞，每孔200 μl。

1.2.3 CCK8檢測(cè)T細(xì)胞增值能力含藥血清藥物干預(yù)后加入10 μl CCK8：培養(yǎng)1～4小時(shí)。測(cè)定450 nm吸光度：檢測(cè)波長(zhǎng)450～490 nm，參比波長(zhǎng)600～650 nm。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Lewis肺癌細(xì)胞配制成密度為1.0×105/ml接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(低、中、高劑量組以及NS對(duì)照組)含藥血清1 ml，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)72 h，予不含EDTA的胰蛋白酶后，收集置1.5 ml離心管后離心5 min，0.9%NS清洗2次，棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇1 ml，固定4℃過(guò)夜。固定液，PBS清洗2次，加4 ℃預(yù)冷PBS 500 μl重懸細(xì)胞，后加RNase A、PI避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期情況。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎填精方含藥血清干預(yù)抑制Lewis肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)采用倒置顯微鏡觀察低、中、高濃度含藥血清干預(yù)對(duì)細(xì)胞密度的影響。Lewis肺癌細(xì)胞接種后，分別給予對(duì)照組、低劑量、中劑量和高劑量的補(bǔ)腎填精方含藥血清干預(yù)細(xì)胞24 h后，在10×和20×的顯微鏡下觀察細(xì)胞密度。與對(duì)照組相比，不同濃度的含藥血清干預(yù)顯著降低肺癌細(xì)胞密度，濃度越高，抑制越明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 顯微鏡觀察Lewis肺癌細(xì)胞密度的影響

2.2 對(duì)Lewis肺癌周期的影響與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組3組均可顯著增加G2/M期細(xì)胞的百分比(P<0.05)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量補(bǔ)腎填精方組G2/M期細(xì)胞百分比為最高(15.59%)，這提示補(bǔ)腎填精方含藥血清可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯到G2/M期從而抑制Lewis肺癌細(xì)胞。見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)腎填精方作用于A549細(xì)胞72 h細(xì)胞周期時(shí)相分布 (只，

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05

2.3 補(bǔ)腎方干預(yù)顯著抑制Lewis肺癌T細(xì)胞活力采用CCK-8檢測(cè)補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)對(duì)Lewis肺癌T細(xì)胞活力的影響。Lewis細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度的補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)24 h后，采用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力，與對(duì)照組相比，P<0.05。與對(duì)照組(100%)相比，不同濃度的補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)能夠顯著降低Lewis肺癌細(xì)胞的活力，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)(P<0.05)。可見(jiàn)，補(bǔ)腎填精方含藥血清具有顯著降低Lewis肺癌細(xì)胞活力的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 CCK-8檢測(cè)補(bǔ)腎方含藥血清干預(yù)對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞活力的影響

3 討論

肺癌屬于中醫(yī)學(xué)“胸痛、喘證、肺積、哮證、咯血、咳嗽”等范疇。肺為腎之母，肺癌發(fā)病日久，子病及母，久則腎精耗傷，腎氣腎陰陽(yáng)虧虛，反致肺臟虧虛，肺失宣降失職，外邪侵襲，留置肺絡(luò)，痰濕、瘀血內(nèi)阻成瘤。肺腎虧虛，痰濕瘀血內(nèi)阻為肺癌形成的主要病機(jī)之一。腎藏精，為先天之本，腎主一身陰陽(yáng)，為元陰元陽(yáng)之守；而腎為水，肺為金，金能生水，水能潤(rùn)金，故金水相生法、補(bǔ)腎培元為肺癌治療大法?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》說(shuō):“腎生骨髓”。及目前“腎虛致瘤”學(xué)說(shuō)。目前研究顯示，腎虛影響機(jī)體免疫功能，補(bǔ)腎能提高機(jī)體免疫功能[3]。免疫功能與中醫(yī)學(xué)的腎主骨生髓密切相關(guān)，現(xiàn)代研究中認(rèn)為骨髓干細(xì)胞有造血功能，體液及細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，皆是中醫(yī)學(xué)“腎”功能的一個(gè)組成部分。而腎主封藏失職，則能量失守，能量失守是腫瘤發(fā)生的根本原因。

本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)腎填精方由枸杞子、制何首烏和淫羊藿三味藥組成，方中枸杞子性味甘平，歸肝腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎，精血明目之功。近代研究發(fā)現(xiàn)枸杞子含有的枸杞多糖通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)影響T細(xì)胞免疫[4]。梁淑軒等[5]將枸杞多糖硒化后發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤能力更顯著，且呈劑量依賴(lài)性。何首烏味苦甘澀，性微溫，歸肝腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、益精血，強(qiáng)筋骨之功?！侗静菥V目》謂之能養(yǎng)血益肝，固精益腎，為滋補(bǔ)良藥，不寒不燥，功在地黃、天冬諸藥之上”。制何首烏多糖[6]具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，具有較好增強(qiáng)免疫功能。淫羊藿味辛、甘，性溫，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)，強(qiáng)筋健骨的功效?，F(xiàn)代研究證實(shí)，淫羊藿苷可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)Caspase-3、9，周期蛋白A、B1，CDK2，p21等蛋白及基因表達(dá)從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。其提取物淫羊藿苷可通過(guò)恢復(fù)T細(xì)胞功能，提高機(jī)體免疫功能，進(jìn)而產(chǎn)生抗腫瘤免疫[8，9]?；谀I為水火之宅，內(nèi)有人體陰陽(yáng)之源，三藥合用，枸杞子、制何首烏補(bǔ)腎中之陰，淫羊藿補(bǔ)腎中之陽(yáng)，立足于補(bǔ)益腎氣，共奏補(bǔ)腎調(diào)元，培補(bǔ)陰陽(yáng)，金水相生之效。

在內(nèi)外因素下，機(jī)體功能失調(diào)，內(nèi)環(huán)境紊亂，特別是機(jī)體免疫功能及免疫微環(huán)境的破壞是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及發(fā)展的主要原因?；谡{(diào)整腫瘤免疫微環(huán)境的治療大法，肺癌的免疫治療已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床，療效確切。而中醫(yī)學(xué)大量研究證實(shí)，金水相生法可明顯改善肺部癥狀。因此，其機(jī)理可能與金水相生法能改善機(jī)體免疫功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究證實(shí)補(bǔ)腎填精方對(duì)肺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，其中以高劑量中藥組對(duì)肺癌細(xì)胞影響效果更佳。從CCK檢測(cè)T細(xì)胞增值能力，提示高劑量的補(bǔ)腎填精方對(duì)肺癌細(xì)胞有抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用。與對(duì)照組相比，P<0.05。補(bǔ)腎填精方含藥血清可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯到G2/M期從而抑制Lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

毋庸置疑，一定劑量的補(bǔ)腎填精方對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞具有一定的腫瘤抑制作用，根據(jù)對(duì)T細(xì)胞活檢影響，我們推測(cè)補(bǔ)腎填精方對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞可能具有抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用，改善腫瘤的免疫微環(huán)境作用。但其抗腫瘤通過(guò)哪些信號(hào)通路機(jī)理不明，后期研究中將進(jìn)一步明確其機(jī)理，以期能更好地運(yùn)用于臨床，發(fā)揮中醫(yī)抗腫瘤優(yōu)勢(shì)。