基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析甲基化促進(jìn)精原細(xì)胞瘤進(jìn)程的作用機(jī)制

陳賽鵬，王嘉南，王 林，彭華紅，肖龍飛，楊 闊

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211）

睪丸生殖細(xì)胞瘤（Testieular Germ Cell Tumor，TGCTs）占睪丸原發(fā)性惡性腫瘤的90%以上，是15～35歲男性最常見(jiàn)的實(shí)體瘤[1]。臨床上將TGCT分為精原細(xì)胞瘤和非精原細(xì)胞瘤兩大類，后者可細(xì)分為胚胎細(xì)胞癌、絨毛膜癌、卵黃囊瘤和畸胎瘤[2]。American Joint Committee on Cancer(AJCC)根據(jù)精原細(xì)胞瘤的增殖和轉(zhuǎn)移的程度分為精原細(xì)胞瘤Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期。Ⅰ期精原細(xì)胞瘤術(shù)后通過(guò)密切隨訪,藥物輔助化療和輔助放療可以完全治愈[3]。然而,Ⅱ期、Ⅲ期的術(shù)后的存活率較低,術(shù)后一般以放療和化療為主[4]。目前精原細(xì)胞瘤的組學(xué)研究進(jìn)展尚不完善，因此,探索精原細(xì)胞瘤的基因表達(dá)譜對(duì)了解原始生殖細(xì)胞與腫瘤形成的關(guān)系是非常重要的。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，它可以在不改變DNA序列的情況下改變基因組的表達(dá)。DNA甲基化的主要機(jī)制是將甲基(CH3)與CG二核苷酸的細(xì)胞因子結(jié)合，從而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性，以及誘導(dǎo)DNA與蛋白質(zhì)相互作用以控制基因表達(dá)的方式[5]。許多研究表明，DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，主要表現(xiàn)為DNA甲基化模式和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的改變[6]。然而，到目前為止還沒(méi)有系統(tǒng)的分析甲基化在精原細(xì)胞瘤進(jìn)展中的作用。TCGA(The Cancer Genome Atlas)中有156例精原細(xì)胞瘤的450K甲基化數(shù)據(jù)和156例精原細(xì)胞瘤的RNA seq數(shù)據(jù)。因此筆者將TCGA甲基化芯片數(shù)據(jù)與RNA seq數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，分析甲基化調(diào)控的基因表達(dá)在精原細(xì)胞瘤惡性進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用。

1 資料與方法

1.1 差異基因的篩選 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載106例精原細(xì)胞瘤Ⅱ期、Ⅲ期和26例Ⅰ期樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，使用GDCRNAtools R軟件包進(jìn)行差異基因分析，并取fold change為2，F(xiàn)DR為0.05作為篩選閾值，并將篩選的差異基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析。

1.2 甲基化差異位點(diǎn)的篩選 在分析甲基化數(shù)據(jù)時(shí)，使用ELMER R軟件包來(lái)進(jìn)行甲基化差異位點(diǎn)分析。ELMER R包參數(shù)設(shè)定

createMAE函數(shù)：linearize.exP=TRUE

get.diff.meth函數(shù)：minSubgroupFrac=1,sig.dif=0.2,cores=1，pvalue=0.05,mode="supervised"

GetNearGenes函數(shù)：numFlankingGenes=20

get.pair函數(shù)：minSubgroupFrac=1,raw.pvalue=0.05,filter.probe=FALSE,cores=1,mode="supervised",Pe=0.05

enriched.motif.hyper函 數(shù) ：min.incidence=10,lower.OR=1.1

其他參數(shù)保持默認(rèn)。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的156例精原細(xì)胞瘤標(biāo)本的450K甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，每個(gè)芯片有485 577個(gè)甲基化檢測(cè)位點(diǎn)，獲取Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅰ期的差異甲基化位點(diǎn)，然后將關(guān)聯(lián)差異甲基化位點(diǎn)的前后20個(gè)基因作為可能受甲基化調(diào)控的基因。

1.3 差異甲基化位點(diǎn)的差異基因配對(duì)分析 將獲得差異甲基化位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)基因與Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅰ期的差異基因取交集，找出差異甲基化位點(diǎn)周?chē)酗@著表達(dá)差異的基因，并將基因表達(dá)量與甲基化位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 差異基因的生存曲線分析 將差異甲基化位點(diǎn)-差異基因配對(duì)進(jìn)行生存分析，尋找顯著影響精原細(xì)胞瘤患者的生存情況的受甲基化調(diào)節(jié)的差異基因。

2 結(jié)果

2.1 通過(guò)差異基因分析，筆者找到了864個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因有410個(gè)，下調(diào)基因有456個(gè)，差異表達(dá)火山圖如圖1A所示，差異基因類型的分布如圖1B所示。

圖1 精原細(xì)胞瘤差異基因的篩選及分類Fig 1 Screening and classification of differential genes in seminoma

2.2 將甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)的分析，顯示Ⅱ期、Ⅲ期精原細(xì)胞瘤的平均甲基化水平高于Ⅰ期，如圖2。筆者對(duì)Ⅱ期、Ⅲ期精原細(xì)胞瘤與Ⅰ期精原細(xì)胞瘤之間的差異甲基化位點(diǎn)進(jìn)行了分析，顯示162個(gè)在Ⅱ期、Ⅲ期精原細(xì)胞瘤中甲基化水平升高的位點(diǎn)。

圖2 Ⅱ期Ⅲ期和Ⅰ期的差異甲基化水平分析Fig 2 Analysisofdifferential methylation levels ofstageⅡ & Ⅲ and stageⅠ

2.3 將篩選出來(lái)的差異甲基化位點(diǎn)與前后最近的20個(gè)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)，并且將這些基因與差異表達(dá)基因取交集，找出表達(dá)水平受甲基化調(diào)節(jié)的基因，得到22個(gè)差異甲基化位點(diǎn)-差異表達(dá)基因配對(duì)。對(duì)配對(duì)的甲基化水平和基因表達(dá)水平進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析，最終得到了差異基因的表達(dá)與甲基化水平存在負(fù)相關(guān)的基因KCNC1，具有較強(qiáng)的相關(guān)性，結(jié)果如圖3。

圖3 高甲基化與KCNC1表達(dá)的關(guān)系分析Fig 3 Analysis of the relationship between hypermethylation and the expression of KCNC1

2.4 GEPIA在線工具（http://gepia.cancer-pku.cn）對(duì)22個(gè)差異甲基化位點(diǎn)-差異表達(dá)基因配對(duì)的基因進(jìn)行了生存分析，發(fā)現(xiàn)KCNC1對(duì)精原細(xì)胞瘤患者的生存期有顯著影響，高甲基化與KCNC1的低表達(dá)相關(guān)，并且KCNC1的低表達(dá)與更差的預(yù)后有關(guān)。筆者比較了KCNC1在精原細(xì)胞瘤和正常睪丸組織之間的差異，結(jié)果顯示精原細(xì)胞瘤中的KCNC1表達(dá)量較低，在正常睪丸組織以及Ⅰ期和Ⅱ期、Ⅲ期精原細(xì)胞瘤中的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，如圖4。

圖4 KCNC1在所有腫瘤和正常組織中的表達(dá)及在精原細(xì)胞瘤中的無(wú)進(jìn)展生存期分析Fig 4 Expressions of KCNC1 in all tumors and normal tissues and disease-free survival in seminoma

3 討論

目前，對(duì)于精原細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展不是很完善，最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS)發(fā)現(xiàn)KITLG、SPRY4、T1、TERT、ATF7IP 與睪丸生殖細(xì)胞瘤的易感性相關(guān)[7-12]。對(duì)于精原細(xì)胞瘤的基因組學(xué)的研究也在逐漸開(kāi)展。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，然而不同基因中腫瘤特異性甲基化的改變被證明具有不同的生物學(xué)效應(yīng)。一些研究表明，低甲基化通過(guò)激活不同腫瘤中的致癌基因而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[13]。也有證據(jù)表明，高甲基化可以抑制腫瘤抑癌基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。例如,在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中高甲基化可以使腫瘤抑制基因Rb的表達(dá)相比無(wú)甲基化減少到 8%[6，13]。

本文通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，分析篩選了TCGA上傳的精原細(xì)胞瘤患者的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，確定了22個(gè)差異基因在Ⅱ期Ⅲ期精原細(xì)胞瘤中表達(dá)隨著甲基化的程度降低，因此考慮高甲基化在精原細(xì)胞瘤中通過(guò)抑制了這些基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了精原細(xì)胞瘤的進(jìn)展。通過(guò)分析差異基因的生存曲線，發(fā)現(xiàn)高甲基化導(dǎo)致基因KCNC1低表達(dá)的精原細(xì)胞瘤患者生存期短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的推廣，精原細(xì)胞瘤的治療不僅僅局限于手術(shù)治療，通過(guò)基因的靶向藥物治療，可以抑制精原細(xì)胞瘤的進(jìn)展，從而改善患者的預(yù)后。

KCNC1這個(gè)基因編碼了一個(gè)完整膜蛋白家族，該家族可介導(dǎo)興奮膜的電壓依賴性鉀離子滲透性[14]。K+通道是質(zhì)膜中種類最豐富的離子通道，廣泛分布于包括癌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞中。能與生化信號(hào)級(jí)聯(lián)進(jìn)行串?dāng)_，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)K濃度、產(chǎn)生膜電位、介導(dǎo)細(xì)胞體積變化、參與Ca信號(hào)傳遞、與膜受體和下游效應(yīng)子在分子復(fù)合物內(nèi)直接相互作用等方式，幾乎調(diào)控所有細(xì)胞過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出K通道的異常表達(dá)和活性模式通常通過(guò)影響Ca激活的IK或者BK通道，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)化、惡性進(jìn)展、轉(zhuǎn)移或耐藥[15-16]。也有研究表明，K+通道在乳腺癌中影響腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展[17]。K+通道在精原細(xì)胞瘤中缺乏研究，在精原細(xì)胞瘤中發(fā)揮的作用也不清楚，本文通過(guò)篩選得到KCNC1基因，高甲基化會(huì)降低KCNC1的表達(dá)并且促進(jìn)了精原細(xì)胞瘤的進(jìn)展。已有的研究表明KCNC1能介導(dǎo)興奮膜的電壓依賴性鉀離子滲透性，促進(jìn)K+通道的激活，抑制精原細(xì)胞瘤的進(jìn)展。