間歇性低氧干預(yù)提高心梗大鼠心功能和運(yùn)動(dòng)耐量

徐凱月，孟祥雪，黃 傳，史 昱，萬(wàn)春曉

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，天津300052）

心血管疾病已成為威脅人類生存的重大疾病之一。盡管心血管疾病的治療技術(shù)不斷發(fā)展，但心肌梗死及其后的心力衰竭仍是現(xiàn)代社會(huì)心血管疾病死亡的主要原因[1]。2013年美國(guó)心臟協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全美每天有至少2 200人死于心血管疾病。心肌梗死后會(huì)引起心肌纖維化，心臟收縮功能下降,心室擴(kuò)張[2]，導(dǎo)致心臟功能減退，影響生存質(zhì)量。因此，梗死后的心肌保護(hù)，對(duì)于心梗后人群提高心臟功能和改善生存質(zhì)量具有重要意義。

心臟康復(fù)作為心血管疾病治療中藥物和手術(shù)的有效補(bǔ)充，在改善心臟功能方面得到廣泛認(rèn)可[3]。近年來(lái)，間歇性低氧干預(yù)在基礎(chǔ)研究中得到關(guān)注，大量實(shí)驗(yàn)證明其能有效保護(hù)缺血再灌注大鼠的心肌，改善心臟功能[4]，但對(duì)于梗死后存活心肌的影響以及相關(guān)分子機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）在適應(yīng)低氧和缺血應(yīng)激的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。一方面，激活的AMPK可以通過(guò)抑制腫瘤壞死因子（TNF-α），減少細(xì)胞絲素C和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的釋放，從而減少細(xì)胞凋亡[6]，降低心肌纖維化，減少心梗面積[7]；另一方面，可以通過(guò)增加葡萄糖的攝取[8]，從而促進(jìn)骨骼肌收縮，提高運(yùn)動(dòng)耐量[9]。因此，AMPK能在保護(hù)心肌細(xì)胞、提高運(yùn)動(dòng)耐量等方面發(fā)揮重要作用。但間歇性低氧干預(yù)與AMPK的相關(guān)研究甚少，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建大鼠心梗模型進(jìn)行間歇性低氧干預(yù)，觀察AMPK表達(dá)及心功能和運(yùn)動(dòng)耐量變化關(guān)系，旨在探究間歇性低氧干預(yù)對(duì)梗死后心肌的影響以及分子機(jī)制，從而拓展心臟康復(fù)方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 28只成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于北京華阜通有限公司。飼養(yǎng)地點(diǎn)為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫為（23±2）℃，相對(duì)濕度為50%±10%，晝夜節(jié)律為12 h明暗循環(huán)。無(wú)菌飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物自由獲取食物和水。

1.1.2 主要試劑 MASSON三色染色試劑盒 (北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)G1340)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（美國(guó)Abcam公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（美國(guó)Abcam公司）。

1.1.3 主要儀器 小動(dòng)物人工呼吸機(jī)（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)DW3000）；有機(jī)玻璃動(dòng)物低氧倉(cāng)（山東煙臺(tái)宏遠(yuǎn)氧業(yè)有限公司，型號(hào)DS-3）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，型號(hào)ZS-PT）；超聲儀（加拿大Visualsonics Inc公司，型號(hào) Vevo770）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為空白組（Sham，n=6）、空白低氧組（Sham-IH，n=6）、心梗組（MI，n=8）、心梗低氧組（MI-IH，n=8）。

1.2.2 動(dòng)物模型制備 大鼠腹腔麻醉注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）后取仰臥位，使用小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，對(duì)大鼠進(jìn)行口腔插管，保持呼吸節(jié)律與呼吸機(jī)模式一致。備皮，胸骨左緣捫及心臟搏動(dòng)處縱行切開(kāi)皮膚約3 cm，逐層鈍性分離，于第四肋間開(kāi)胸，暴露心臟、血管。在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，以6/0縫線于左心耳根部下方2 mm處進(jìn)針，進(jìn)針深度0.5 mm，術(shù)中心肌顏色變白，心電圖II導(dǎo)聯(lián)顯示ST段升高＞0.1 mV以上，確認(rèn)為心肌缺血。待心電圖ST段抬高穩(wěn)定10min后，予以結(jié)扎?？瞻捉M大鼠以同樣方法暴露心臟，但不進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈前降支的結(jié)扎。

1.2.3 干預(yù)方法 術(shù)后1周進(jìn)行干預(yù)，將Sham-IH組和MI-IH組放入動(dòng)物低氧倉(cāng)內(nèi)，模擬海拔5000m、氧濃度13%的低氧環(huán)境。每天干預(yù)4 h，每周5 d，共干預(yù)4周。Sham組和MI組放于常氧環(huán)境中，干預(yù)時(shí)間與低氧組相同。

1.2.4 運(yùn)動(dòng)耐量 干預(yù)4周后，將各組大鼠放于15°傾斜的跑臺(tái)上，起始速度為6 m/min，每3 min速度增加3 m/min，至大鼠力竭為止，跑動(dòng)的總距離作為大鼠的運(yùn)動(dòng)耐量[10]。

1.2.5 超聲檢查 分別在術(shù)后1周和干預(yù)4周后對(duì)各組大鼠行心臟超聲檢查，以Sham組大鼠為對(duì)照，使用M模塊采集左心室射血分?jǐn)?shù)，數(shù)值取測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.2.6 免疫組織學(xué)染色 處死動(dòng)物，取下心臟，生理鹽水反復(fù)沖洗。在心臟結(jié)扎點(diǎn)至心尖部位取約厚度3 mm的橫截面，置10%的福爾馬林中固定。包埋制備石蠟切片，切成厚度7 μm石蠟切片，脫水并進(jìn)行MASSON染色。膠原纖維成分呈藍(lán)色，正常心肌呈紅色。采用Image J圖像采集軟件計(jì)算心肌梗死面積所占比例（藍(lán)色部分面積/藍(lán)色+紅色部分的總面積）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 Western blot法檢測(cè) 提取心肌組織蛋白，冰上裂解并離心，取上清液存于EP管中。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加裂解液保存于-80℃冰箱備用。配制不同濃度的濃縮膠，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST清洗，并用牛奶封閉2 h。4℃慢搖過(guò)夜孵育一抗，清洗后室溫慢搖1 h孵育二抗。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，并用Image J分析軟件進(jìn)行光密度值計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0和GraphPad Prism 6.0軟件處理，并以±s表示。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析及組間比較。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織學(xué)染色比較 如表1所示，與MI組相比，干預(yù)4周后MI-IH組的梗死面積比例明顯下降（P＜0.001）（圖 1）。

表1 各組大鼠的心梗面積比例結(jié)果比較(±s,%)Tab 1 Comparison of infarct size ratio between groups(±s,%)

表1 各組大鼠的心梗面積比例結(jié)果比較(±s,%)Tab 1 Comparison of infarct size ratio between groups(±s,%)

MI-IH組與MI組比較，***P＜0.001

組別 n 心梗面積比例Sham 6 0 Sham-IH 6 0 MI 8 25.78±3.74 MI-IH 8 14.23±0.95***

圖1 干預(yù)4周后，大鼠心臟石蠟切片MASSON染色（×40）Fig 1 MASSON staining of paraffin section for rats after four-week intervention（×40）

2.2 心臟超聲檢查結(jié)果比較 如圖2所示，干預(yù)4周后，MI-IH組的左心室射血分?jǐn)?shù)比干預(yù)前（Base）明顯提高（P＜0.001），比4周MI組顯著提高（P＜0.001），4周MI組比干預(yù)前也有提高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果Fig 2 Results of cardiac ultrasound between groups

2.3 運(yùn)動(dòng)耐量比較 如圖3所示，干預(yù)4周后，各組的運(yùn)動(dòng)耐量均較干預(yù)前（Base）有明顯增高（P＜0.001），MI-IH 組比 MI組出現(xiàn)顯著增高（P＜0.001）。

2.4 AMPK蛋白表達(dá)的影響 如圖4所示，干預(yù)4周后，MI-IH組AMPK表達(dá)比MI組明顯增加（P＜0.05），同時(shí)比Sham-IH組明顯增加（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠運(yùn)動(dòng)耐量比較Fig 3 Comparison of exercise tolerance between groups

圖4 各組大鼠AMPK蛋白的表達(dá)情況Fig 4 The expressions of AMPK protein between groups

3 討論

心肌梗死是當(dāng)今世界主要的致死因素之一。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，藥物和技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用以及管理模式的改進(jìn)，心?；颊叩乃劳雎曙@著下降[1]。梗死后存活患者如何改善心臟功能，提高運(yùn)動(dòng)能力，以及預(yù)防再梗死和心血管事件，已經(jīng)成為心梗后關(guān)注的主要內(nèi)容。歐洲心臟病學(xué)學(xué)會(huì)、美國(guó)心臟協(xié)會(huì)均將心臟康復(fù)列為心血管疾病治療中最高級(jí)別I級(jí)推薦[11]。心臟康復(fù)對(duì)于提高心臟和運(yùn)動(dòng)能力具有重要作用[3]。在心臟康復(fù)研究中，間歇性低氧干預(yù)作為一種安全、無(wú)創(chuàng)、有效的方法，大多作為預(yù)處理手段應(yīng)用于心肌缺血再灌注的研究中，發(fā)現(xiàn)可以減少氧化應(yīng)激損傷和心肌梗死面積[4,12]。但是對(duì)于梗死后心肌的影響鮮有研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后存活大鼠進(jìn)行間歇性低氧干預(yù)可以顯著減少梗死面積和提高左心室射血分?jǐn)?shù)。心梗面積減少使存活心肌增加，能提高心肌收縮力，改善射血分?jǐn)?shù)[13]。射血分?jǐn)?shù)是預(yù)測(cè)心肌梗死患者不良心血管事件和死亡率的重要指標(biāo)[14]。射血分?jǐn)?shù)明顯下降的心?；颊咭荒陜?nèi)的不良心血管事件發(fā)生率與死亡率比左心室功能正常的心?；颊唢@著升高[15]。本研究通過(guò)心肌梗死面積比例和左室射血分?jǐn)?shù)的變化，揭示了間歇性低氧干預(yù)對(duì)心肌梗死后大鼠的心臟保護(hù)作用。

運(yùn)動(dòng)耐量是體現(xiàn)機(jī)體活動(dòng)能力的指標(biāo)，對(duì)衡量心梗患者能否回歸生活和工作具有重要意義[16]，同時(shí)也是預(yù)測(cè)心力衰竭和其他心血管疾病死亡率的重要因素[17]。運(yùn)動(dòng)耐量的提高能有效預(yù)防心血管病人的心力衰竭[18]，提高患者的生活質(zhì)量。美國(guó)一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)19年的多中心臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者的死亡率的下降與運(yùn)動(dòng)耐量提高密切相關(guān)，運(yùn)動(dòng)耐量每增加1 MET，死亡率隨之降低8%～14%[19]。本研究顯示4周干預(yù)后MI-IH組的運(yùn)動(dòng)耐量比干預(yù)前明顯增加，同時(shí)比4周常氧干預(yù)的MI組明顯增加，說(shuō)明間歇性低氧干預(yù)有助于提高心梗后大鼠的活動(dòng)能力，促進(jìn)其更好地參與日?；顒?dòng)。

AMPK在控制炎癥、調(diào)節(jié)能量代謝、保護(hù)心臟等方面發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可以減少心肌細(xì)胞的凋亡[20]。Kim等[21]發(fā)現(xiàn)缺血再灌注小鼠模型心肌內(nèi)激活的AMPK，可以減少心梗面積，產(chǎn)生心臟保護(hù)作用。本研究顯示間歇性低氧干預(yù)4周后MI-IH組的AMPK蛋白表達(dá)明顯增加，且研究中也證實(shí)了MI-IH組的心肌梗死面積比例減少，左室射血分?jǐn)?shù)提高，提示心梗大鼠在間歇性低氧干預(yù)過(guò)程中，產(chǎn)生的梗死后心肌保護(hù)可能與心肌AMPK的增加有關(guān)。

本研究通過(guò)4周的間歇性低氧干預(yù)，從AMPK蛋白表達(dá)、心梗面積比例、射血分?jǐn)?shù)、運(yùn)動(dòng)耐量方面證明了間歇性低氧干預(yù)對(duì)心梗大鼠會(huì)產(chǎn)生有效的心臟保護(hù)作用，提高活動(dòng)能力，這可能與心肌AMPK增加有關(guān)。由于間歇性低氧干預(yù)對(duì)心?？祻?fù)的作用機(jī)制極其復(fù)雜，本研究?jī)H探討了AMPK在心梗后心肌保護(hù)中的變化，對(duì)于AMPK上下游的信號(hào)通路變化未有進(jìn)一步的探索，后續(xù)研究中將深入探討，為臨床上心梗患者的心臟康復(fù)提供新思路。