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    SUZ12過表達(dá)及敲減惡性外周神經(jīng)鞘瘤穩(wěn)定細(xì)胞株的建立及其意義

    2019-10-17 05:47:56李新宇朱香熹孫碩遙劉嘉岳趙玉龍李光明
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株質(zhì)粒測(cè)序

    張 靜 ,高 雅 ,李新宇 ,朱香熹 ,孫碩遙 ,肖 可 ,王 靜 ,劉嘉岳 ,趙玉龍 ,李光明 ,朱 澤

    (1.天津醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系,天津300070;2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,天津300070;3.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)臨床醫(yī)學(xué)系,珠海519090;4.多倫多大學(xué)圣喬治校區(qū),多倫多ONM5S)

    惡性外周神經(jīng)鞘瘤(malignant peripheral nerve sheath tumor,MPNST)是一類具有高度惡性,發(fā)展迅速,易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)且預(yù)后差的侵襲性軟組織肉瘤,約占所有軟組織肉瘤的5%~10%,其中將近50%的MPNST與NF1基因相關(guān),NF1的病人一生中有10%~15%的風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)變成MPNST[1-4]。另外,腫瘤抑制因子(TP53和p16INK4A)的喪失和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)(例如EGFR或PDGFR)過度激活在神經(jīng)纖維瘤的惡性轉(zhuǎn)化中也起著重要作用。因此,基于這種關(guān)聯(lián),MPNST最經(jīng)典基因?qū)W研究大多集中在NF1基因的缺失以及TP53和CDKN2A/p16基因的缺失上[5]。然而最近的一些對(duì)MPNST病人的組織標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序的研究結(jié)果顯示,在MPNST中PRC2的組成單元SUZ12和EDD的突變失活也屬頻發(fā)事件[5-9]。PRC2可以調(diào)節(jié)組蛋白H3的27位點(diǎn)上的酪氨酸三甲基化,而SUZ12作為PRC2復(fù)合體的重要組分,可以通過穩(wěn)定PRC2復(fù)合體保證H3K27me3在表觀遺傳修飾過程中功能正常發(fā)揮。

    CRISPR/Cas9是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng),通過crRNA識(shí)別、Cas蛋白裂解來抵抗病毒和噬菌體的入侵,因其敲除效率高,脫靶率低,敲除效果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)被用于替代傳統(tǒng)的TALEN技術(shù)和ZEN技術(shù),已成為一種主流的基因編輯工具[10-11]。因此,為了進(jìn)一步研究SUZ12基因在MPNST中的作用,筆者使用慢病毒載體構(gòu)建SUZ12過表達(dá)及CRISPR/Cas9敲減的MPNST穩(wěn)定細(xì)胞株,為針對(duì)SUZ12在MPNST中的生物學(xué)功能、作用機(jī)制和疾病診斷治療的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料和試劑 ST88-14細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院楊吉龍教授饋贈(zèng);293T細(xì)胞和大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)保存;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;慢病毒載體系統(tǒng)(GV492、GV371、pHelper1.0、pHelper2.0),Lenti-CAS9-puro 慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Promega公司;TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Genechem公司;FastQuant RT Kit、SuperRealPreMix Plus購(gòu)自天根公司;SUZ12引物由北京索真公司合成;MTT試劑盒購(gòu)自索萊寶公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MPNST細(xì)胞系ST88-14在含10%的胎牛血清和1%的雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),37℃,7.5% CO2溫箱中孵育。

    1.3 SUZ12基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

    1.3.1 SUZ12目的基因PCR擴(kuò)增 SUZ12基因PCR擴(kuò)增引物,正向引物:5′-AGGTCGACTCTAGA GGATCCCGCCACCATGGCGCCTCAGAAGCACGGC GGTG-3′,反向引物:5′-TCCTTGTAGTCCATACCG AGTTTTTGTTTTTTGCTCTGTTTTG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為2 261bp。PCR 體系反應(yīng)條件:98℃ 5 min,98℃ 10 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 90 s,循環(huán) 30次,72 ℃ 8 min。擴(kuò)增完成后,1.5%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定結(jié)果。

    1.3.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建 將GV492載體用BamHI/AgeI酶切,PCR產(chǎn)物與載體進(jìn)行交換,構(gòu)建重組質(zhì)粒(設(shè)置一組不含SUZ12片段的質(zhì)粒作為對(duì)照組)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞,將其涂布在含有氨芐青霉素的平板上,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,之后進(jìn)行菌落PCR的鑒定,正義鏈:5′-GATGTTAATGAAGGAGAGAAAG-3′,反義鏈:5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)化,挑菌,質(zhì)粒抽提,進(jìn)行測(cè)序鑒定。

    1.4 SUZ12敲減載體的構(gòu)建

    1.4.1 sgRNA靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)與合成 在NCBI中明確SUZ12基因的CDS外顯子區(qū)域,使用麻省理工學(xué)院的CRISPR設(shè)計(jì)工具(http//crispr.mit.edu/)設(shè)計(jì)3對(duì)SUZ12基因的sgRNA序列,并在其兩端加入BbsⅠ位點(diǎn),序列見表1。引物退火形成帶有粘性末端的雙鏈,稀釋200倍后使用。

    表1 3對(duì)特異性sgRNA序列Tab 1 3 pairs of specific sgRNA sequences

    1.4.2 sgRNA載體的構(gòu)建 將GV371載體用BbsⅠ酶切,與退火形成雙鏈的sgRNA混合,配置酶切連接反應(yīng)體系進(jìn)行連接,酶切體系:Vector plasmid(100 ng/μL)1 μL,Oligo 雙鏈 DNA(0.089 μmol/L)2 μL,10×Buffer Tango 2 μL,DTT(10 mmol/L)1 μL,ATP (10 mmol/L)1 μL,T7 DNA Ligase 0.5 μL,BbsI 1 μL,H2O 11.5 μL;將上述反應(yīng)物置于 PCR 儀,37 ℃5 min,21 ℃ 5 min,16 ℃ 30 min,共 6 個(gè)循環(huán)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞中,接種到含Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)箱中過夜。挑菌,質(zhì)粒抽提,進(jìn)行測(cè)序鑒定。

    1.5 慢病毒包裝與滴度測(cè)定

    1.5.1 慢病毒包裝 將GV載體質(zhì)粒、pHelper1.0載體質(zhì)粒、pHelper 2.0載體質(zhì)粒按照一定比例(20 μg∶15 μg∶10 μg) 加到 2.4 mL 的 Opti-MEM 和 100 μL的Lipofectamine2000中,共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集293T細(xì)胞上清液,超速離心去除上清,加入病毒保存液,充分溶解后,高速離心,分裝上清,-80℃保存。

    1.5.2 慢病毒的滴度檢測(cè) 測(cè)定前24 h,接種293T細(xì)胞到96孔板(4×104個(gè)/孔):在EP管中加入90 μL的無血清培養(yǎng)基,取待測(cè)的病毒原液10 μL加入到EP管中,倍比稀釋到最后一管;棄去293T細(xì)胞培養(yǎng)基,加入90 μL稀釋好的病毒溶液,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng);24 h后加入完全培養(yǎng)基,96 h后觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

    1.6 確定慢病毒感染的最適MOI,以及嘌呤霉素(Puro)篩選的最適劑量

    1.6.1 感染預(yù)實(shí)驗(yàn) ST88-14細(xì)胞在病毒感染前一天鋪板,至細(xì)胞匯合度為20%~30%;病毒于冰上融化,依次將病毒稀釋至滴度 1×108TU/mL,1×107TU/mL,1×106TU/mL,吸棄培養(yǎng)液加入病毒及相應(yīng)感染增強(qiáng)液,混勻,繼續(xù)培養(yǎng),12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng);感染72 h后,用熒光顯微鏡觀察感染效率。

    1.6.2 確定嘌呤霉素的最適劑量 將ST88-14細(xì)胞接種于48孔板中,48 h后加入Puro進(jìn)行篩選,Puro 濃度梯度設(shè)置為 0、0.5、1、2、4、6 μg/mL;Puro處理48 h后細(xì)胞全部死亡的最低藥物濃度作為篩選穩(wěn)定株的藥物濃度。

    1.7 慢病毒感染ST88-14細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立1.7.1 過表達(dá)穩(wěn)定株的構(gòu)建 制備密度為3~5×104個(gè)/mL的ST88-14細(xì)胞懸液,每孔100 μL接種到96孔板中,37℃培養(yǎng)24 h;病毒冰上融化,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)MOI值進(jìn)行稀釋;吸棄培養(yǎng)液加入病毒及相應(yīng)感染增強(qiáng)液,在37℃、7.5% CO2溫箱中培養(yǎng),12h后換回常規(guī)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng);感染72 h后,加入2 μg/mL的Puro篩選48 h以上。之后降低Puro濃度到1 μg/mL,繼續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選和擴(kuò)增,同時(shí)收集細(xì)胞行下游RT-qPCR檢測(cè)。

    1.7.2 CRISPR/Cas9敲除穩(wěn)定株的構(gòu)建 制備密度為 3~5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液,每孔 100 μL 接種到96孔板中,37℃培養(yǎng)24 h;Cas9病毒冰上融化,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)MOI值適當(dāng)稀釋;吸棄培養(yǎng)液加入病毒及相應(yīng)感染增強(qiáng)液,在37℃,7.5% CO2溫箱中培養(yǎng),12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng);感染72 h后,加入2 μg/μL的 puromycin篩選至少 48 h以上,得到ST88-14-Cas9細(xì)胞。將ST88-14-Cas9細(xì)胞鋪6孔板,用含1 μg/mL劑量的Puro的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至30%,按照預(yù)實(shí)驗(yàn)感染條件分別感染3個(gè)sgRNA的Lenti-sgRNA-GFP病毒,12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)液,感染48~72 h后,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)情況。用含1 μg/mL的Puro的完全培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng),繼續(xù)傳代、擴(kuò)增進(jìn)行鑒定。

    1.8 SUZ12過表達(dá)和敲減穩(wěn)定株的鑒定

    1.8.1 熒光顯微鏡觀察 用含1 μg/mL Puro篩選兩周后,用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)效率,并拍照。

    1.8.2 RT-qPCR鑒定 用TRIzol提取SUZ12過表達(dá)組和敲減組總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè),SUZ12 引物序列為:SUZ12-F:AGAAAACGAAATCGTGAGGATGG;SUZ12-R:GCAC GTAGGTCCCTGAGAAA。PCR反應(yīng)體系為:cDNA template 4 μL,Primer F (20 μmol/L)2 μL,Primer R(20 μmol/L)2 μL,SYBR qPCR Master Mix 10 μL,Rox Dye 0.04 μL,加水至 20 μL;PCR 反應(yīng)條件:98℃ 2 min,98℃ 10 s,68 ℃ 30 s,循環(huán) 40次,95 ℃ 15 s,60℃1 min,99℃15 s。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

    1.9 SUZ12過表達(dá)和敲減組細(xì)胞增殖活性的測(cè)定 胰酶消化各組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL,每孔200 μL接種到96孔板;分別在 24、48、72 h后棄上清,加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液,孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄上清,每孔加入110 μL DMSO溶液,避光震蕩10 min,490 nm處測(cè)吸光度,繪制增長(zhǎng)曲線。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0處理數(shù)據(jù),多組間均數(shù)比較采用方差分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 過表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 過表達(dá)重組質(zhì)粒SUZ12的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后得到一個(gè)2 261bp的特異性條帶,與預(yù)期大小一致,見圖1。GV492載體經(jīng)BamHI/AgeI酶切后與SUZ12基因構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌后進(jìn)行PCR鑒定,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,得到469bp的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,見圖2。酶切鑒定陽(yáng)性的克隆經(jīng)過測(cè)序,結(jié)果與NCBI中的人SUZ12基因(ID:23512)進(jìn)行比對(duì),序列一致,表明過表達(dá)重組載體構(gòu)建成功。

    圖1 SUZ12基因擴(kuò)增電泳圖Fig 1 PCR amplification of SUZ12

    圖2 重組載體PCR產(chǎn)物鑒定及瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 2 Identification of recombinant vector and agarose gel electrophoresis

    2.2 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建 為了提高敲除效率,設(shè)計(jì)并合成了3條sgRNA靶向序列,載體GV371(U6-sgRNA-SV40-EGFP)BbsⅠ酶切后,分別與退火獲得的3個(gè)目的片段sgRNA連接過夜,轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞、涂板、挑菌、質(zhì)粒抽提、送測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明插入的片段序列與設(shè)計(jì)合成的靶向SUZ12序列一致,見圖3。

    圖3 sgRNA表達(dá)載體陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子測(cè)序峰圖Fig 3 sgRNAexpressionvectorpositiveclonetransformantsequencing peak map

    2.3 病毒滴度的測(cè)定 在倒置熒光顯微鏡下觀察加入不同稀釋倍數(shù)病毒原液的293T細(xì)胞熒光表達(dá)情況顯示,熒光細(xì)胞的數(shù)目隨病毒稀釋倍數(shù)的增加而逐漸減少,估算過表達(dá)慢病毒和3種Lenti-sgRNA的病毒滴度分別為 5×108TU/mL、1×109TU/mL、1×109TU/mL 和 1.5×109TU/mL,見圖 4。

    圖4 不同稀釋倍數(shù)的慢病毒感染293T細(xì)胞的熒光表達(dá)情況(×200)Fig 4 Fluorescenceexpressionsof293Tcellsinfectedwithlentiviruses at different dilutions(×200)

    2.4 慢病毒感染的最適MOI及嘌呤霉素篩選的最適劑量 在不同濃度病毒感染ST88-14細(xì)胞72 h后,用顯微鏡觀察熒光表達(dá)豐度,感染效率80%左右,細(xì)胞生長(zhǎng)良好的組所對(duì)應(yīng)的MOI值即可作為后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)的依據(jù),確定MOI=10為CRISPR/Cas9慢病毒的最佳感染條件,MOI=100為過表達(dá)慢病毒的最佳感染條件,見圖5。待ST88-14細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%時(shí)加入不同濃度的Puro,篩選48 h以上,當(dāng)Puro的濃度大于等于2 μg/mL時(shí),ST88-14細(xì)胞全部死亡,因而確定Puro最適劑量為2 μg/mL,見圖6。

    2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染ST88-14細(xì)胞的結(jié)果 慢病毒轉(zhuǎn)染ST88-14細(xì)胞2周后,用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,鏡下均可見大量綠色熒光蛋白,并且熒光隨著細(xì)胞傳代可持續(xù)表達(dá)(圖7)。

    2.6 穩(wěn)定株細(xì)胞的篩選及鑒定 構(gòu)建好的SUZ12過表達(dá)及敲減慢病毒分別感染ST88-14細(xì)胞后,經(jīng)Puro篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株,提取RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。PT-qPCR結(jié)果顯示過表達(dá)組SUZ12 mRNA表達(dá)量明顯較對(duì)照組高(P<0.05),敲減組SUZ12 mRNA表達(dá)量相比對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。由此說明,SUZ12過表達(dá)和敲減的ST88-14穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功,見圖8。

    圖5 過表達(dá)組相同感染條件下不同濃度病毒感染效率比較(×200)Fig 5 Comparison of virus infection efficiency at different concentrations in the same infection conditions(×200)

    圖6 不同濃度嘌呤霉素篩選48 h后ST88-14的細(xì)胞狀態(tài)Fig 6 Cell state of ST88-14 after 48 hours at different concentrations of puromycin

    圖7 慢病毒轉(zhuǎn)染ST88-14細(xì)胞后穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(×200)Fig 7 Stable expression of green fluorescent protein after transfection of ST88-14 cells with lentivirus(×200)

    圖8 過表達(dá)和敲減組SUZ12 mRNA相對(duì)表達(dá)情況Fig 8 Relative expression of SUZ12 mRNA in overexpressed and knockdown groups

    2.7 SUZ12基因過表達(dá)抑制MPNST細(xì)胞增殖 SUZ12過表達(dá)和敲減穩(wěn)定株構(gòu)建完成后,用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖活性的改變。MTT結(jié)果顯示,過表達(dá)組的細(xì)胞增殖活性與陰性對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05),敲減組的細(xì)胞增殖活性與陰性對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)。表明SUZ12基因過表達(dá)抑制MPNST細(xì)胞增殖。見圖9。

    圖9 過表達(dá)和敲除組細(xì)胞增殖活性的測(cè)定Fig 9 Determination of cell proliferation activity in overexpression and knockout groups

    3 討論

    SUZ12是多疏抑制復(fù)合物2(PRC2)必不可少的組成部分,它可以通過調(diào)控組蛋白和DNA甲基化修飾轉(zhuǎn)錄過程,借此以穩(wěn)定PRC2,使PRC2的功能正常發(fā)揮[12],除此之外,SUZ12還可以影響組蛋白三甲基化的活性,參與EED-EZH2復(fù)合物的功能沉默過程[13]。有研究表明SUZ12在胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、套淋巴細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)明顯高于癌旁組織,并且,SUZ12表達(dá)量的增加提高了腫瘤細(xì)胞無限增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的能力,影響了患者的預(yù)后[14-18]。SUZ12在上述腫瘤中表達(dá)量增加,促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展,然而其在血液系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織,這表明SUZ12表達(dá)量的減少也促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展,同時(shí)具有抑癌的作用[19-20],因而,SUZ12在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了雙向功能。

    本研究組在對(duì)12例MPNST全基因組進(jìn)行深度測(cè)序后發(fā)現(xiàn),在NF1陰性的散發(fā)性MPNST中,SUZ12基因往往呈現(xiàn)缺失狀態(tài)[3],這提示我們SUZ12可能在散發(fā)性MPNST的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用。Andrew等結(jié)合了全外顯子測(cè)序隊(duì)列的分析、TCGA提供的公開數(shù)據(jù),以及對(duì)該疾病的前幾代測(cè)序研究的回顧,分析計(jì)算出了MPNST特異性基因突變率,分別為 NF1(56/64=87.5%),SUZ12(69/123=56.1%),EED(40/123=32.5%),TP53(29/72=40.3%),CDKN2A(54/72=75.0%)[5-9],也證實(shí)在 MPNST 中大多存在SUZ12基因的缺失。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MPNST患者中存在PRC2不同組分功能喪失性突變,而SUZ12和EED的缺失性突變又阻斷了H3K27me3的甲基化進(jìn)程,導(dǎo)致H3K27me3缺失,引起PRC2染色質(zhì)調(diào)節(jié)信號(hào)通路失活[21]。研究者在10%~25%的腎癌、肺癌、胃癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)了H3K36me3的缺失[22-25],而H3K36me3的缺失與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)相關(guān)基因存在協(xié)同致死效應(yīng),WEE1抑制劑AZD1775對(duì)H3K36me3缺失的細(xì)胞更加敏感[26],本課題組之前對(duì)43例MPNST的組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)H3K27me3在65.11%的MPNST患者中均缺失[27],而H3K36me3缺失可以作為用藥靶點(diǎn)也為由PRC2組分突變所致H3K27me3缺失的腫瘤提供了一個(gè)表觀遺傳學(xué)的治療策略。

    本課題組所用的腫瘤細(xì)胞系屬于神經(jīng)細(xì)胞,而神經(jīng)細(xì)胞具有不可分裂的特性,使外源片段的導(dǎo)入比較困難,慢病毒載體是由人類免疫缺陷病毒(HIV-1)改造后產(chǎn)生,具有感染效率高、基因片段容量大、持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)且可感染分裂和非分裂細(xì)胞的特點(diǎn),因此選用慢病毒載體作為基因操作的工具。CRISPR/Cas9是一項(xiàng)新興的基因編輯技術(shù),自問世以來,已廣泛應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域的科學(xué)研究,而且有研究表明,CRISPR/Cas9即使不進(jìn)行單克隆篩選,也可永久顯著敲低目的基因的表達(dá)水平[28]。本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒包裝系統(tǒng)制備了SUZ12過表達(dá)和CRISPR/Cas9敲減慢病毒,分別轉(zhuǎn)染ST88-14細(xì)胞后,成功獲得了能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的SUZ12過表達(dá)和敲減穩(wěn)定細(xì)胞株,RT-qPCR的結(jié)果也證明過表達(dá)組SUZ12 mRNA表達(dá)量明顯較對(duì)照組高(P<0.05),敲減組SUZ12 mRNA表達(dá)量相比對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。MTT結(jié)果顯示,過表達(dá)組的細(xì)胞增殖活性與陰性對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05),敲減組的細(xì)胞增殖活性與陰性對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)。由此說明,SUZ12基因過表達(dá)抑制MPNST細(xì)胞增殖。

    綜上所述,筆者通過本課題組和其他實(shí)驗(yàn)室的研究數(shù)據(jù)確定了SUZ12基因在MPNST中處于缺失狀態(tài),而H3K36me3缺失可以作為治療靶點(diǎn)也為PRC2組分缺失突變所致的H3K27me3缺失提供了治療策略,因此筆者構(gòu)建了SUZ12過表達(dá)和敲減的MPNST穩(wěn)定細(xì)胞株,初步探索SUZ12基因表達(dá)狀態(tài)的變化所引起細(xì)胞增殖的改變,本課題組將進(jìn)一步在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中探索細(xì)胞侵襲遷移、周期等功能的改變,以闡明PRC2功能失活在MPNST的發(fā)病演進(jìn)中的作用及其分子機(jī)制,并為MPNST的治療提供了一個(gè)基于表觀遺傳學(xué)的治療策略。

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