1例高致病性類鼻疽伯克霍爾德菌的鑒定及溯源性分析*

鄭百慧,黎 敏,魯衛(wèi)平，李 進(jìn)

(中國(guó)人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心/陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400042)

類鼻疽是一種由類鼻疽伯克霍爾德菌感染引起的熱帶傳染病。該病原菌主要侵犯人體肺部，早期易出現(xiàn)發(fā)燒、寒戰(zhàn)、咳嗽、惡心、嘔吐、頭痛、腹痛、肌肉痛等癥狀。類鼻疽伯克霍爾德菌侵入人體肺部后，容易形成難治性肺炎、肺部空洞，并可能短期內(nèi)快速地發(fā)展為敗血癥而死亡。此外，類鼻疽伯克霍爾德菌還可能引起腦膜炎、前列腺炎、尿路感染及肝脾等內(nèi)臟的膿腫[1-2]。類鼻疽伯克霍爾德菌感染目前主要流行于泰國(guó)、越南、柬埔寨、菲律賓、澳大利亞等國(guó)家及我國(guó)海南、廣東、廣西、香港、臺(tái)灣等地區(qū)。近期在印度、巴基斯坦和孟加拉國(guó)等也相繼出現(xiàn)一些散在的類鼻疽伯克霍爾德菌感染病例報(bào)道[1-4]。本研究從1例感染發(fā)熱的糖尿病患者血液和尿液標(biāo)本中分離鑒定出類鼻疽伯克霍爾德菌，為明確其診斷和溯源，通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查分析和多位點(diǎn)序列分型(MLST)分型等方法對(duì)該病例進(jìn)行溯源性分析，不僅為全面了解類鼻疽伯克霍爾德菌的分子流行病學(xué)特征奠定了基礎(chǔ)，還為預(yù)防該細(xì)菌的流行性傳播提供建議。

1 病歷摘要

患者，男性，55歲，于2017年5月21日在陸軍特色醫(yī)學(xué)中心高血壓內(nèi)分泌科診斷為“2型糖尿病、糖尿病周圍神經(jīng)病變、有眼糖尿病視網(wǎng)膜病變、高血壓Ⅰ級(jí)極高危組、腦梗死、泌尿系統(tǒng)感染”。入院前先后給予諾和龍1片口服3次/日，二甲雙胍1片口服3次/日控制血糖，血糖控制不佳。詢問(wèn)病史，患者于1月前去過(guò)泰國(guó)旅游，回來(lái)后自覺(jué)全身乏力、倦怠、頭暈等癥狀較前加重，視物旋轉(zhuǎn)，伴行走不穩(wěn)無(wú)耳鳴、頭痛、胸悶、胸痛，未進(jìn)行進(jìn)一步診治，5 d前患者出現(xiàn)惡心、腹脹、無(wú)嘔吐、無(wú)腹痛、腹瀉；3 d前，患者出現(xiàn)全身發(fā)熱，大汗，伴寒戰(zhàn)，尿頻、尿急、尿痛、無(wú)腰痛、茶色尿。入院后，實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)，血紅蛋白(HGB) 93 g/L、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC) 3.21×1012/L、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC) 12.28×109/L、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT) 82.5%、C反應(yīng)蛋白(CRP) 240.4 mg/L，余正常；尿常規(guī)，LEU +++、PRO ++、GLU ++++、BLD ++、鏡檢RBC 88個(gè)/μL、鏡檢WBC 1 450個(gè)/μL；患者入院后間斷發(fā)熱伴尿路刺激，結(jié)合其他檢驗(yàn)項(xiàng)目，于入院當(dāng)日取樣血培養(yǎng)及尿培養(yǎng)標(biāo)本。臨床醫(yī)生剛開始經(jīng)驗(yàn)性使用阿莫西林克拉維酸鉀治療，病情未見好轉(zhuǎn)。待血培養(yǎng)和尿液培養(yǎng)細(xì)菌鑒定結(jié)果均提示為類鼻疽伯克霍爾德菌時(shí)，課題組與專家組共同商討決定按照類鼻疽治療方案(靜脈滴注泰能)進(jìn)行治療，病情便迅速得以控制。由于本院未開設(shè)感染科，與患者家屬溝通后遂轉(zhuǎn)入重慶某三甲醫(yī)院感染科進(jìn)行規(guī)范治療，15 d后患者發(fā)熱等不適癥狀緩解，尿路感染癥狀消失，順利康復(fù)出院。治療期間，醫(yī)院對(duì)該患者進(jìn)行針對(duì)性隔離治療，有效地預(yù)防了類鼻疽病的院內(nèi)感染暴發(fā)流行。

2 細(xì)菌分離鑒定

留取尿液標(biāo)本接種于血平板和麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行鑒定；采集靜脈血液標(biāo)本于血培養(yǎng)瓶中，置于全自動(dòng)血培養(yǎng)儀進(jìn)行檢測(cè)。32.3 h后血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)，取出陽(yáng)性標(biāo)本，直接涂片革蘭染色顯示為革蘭陰性桿菌，同時(shí)將陽(yáng)性標(biāo)本轉(zhuǎn)種于血平板，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行鑒定。用一次性接種環(huán)挑取1～2個(gè)尿培養(yǎng)和血培養(yǎng)陽(yáng)性的單個(gè)菌落，分別采用Vitek-2 Compact GN鑒定卡、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)、API 20NE生化鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因序列分析等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。采用Vitek-2 Compact GN鑒定卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定，結(jié)果為類鼻疽伯克霍爾德菌，生物編碼為0003451513500211，鑒定率為99%。采用MALDI-TOF MS進(jìn)行復(fù)核菌種鑒定，結(jié)果仍為類鼻疽伯克霍爾德菌，鑒定率為99.9%。采用API 20NE生化鑒定系統(tǒng)，結(jié)果顯示阿拉伯糖同化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果見圖1。采用16S rRNA基因序列分析，結(jié)果顯示該菌株序列與類鼻疽伯克霍爾德菌(GenBank No.CP004379.1和CP004380.1)相似度為100%。

3 MLST溯源性分析

以類鼻疽伯克霍爾德菌基因組DNA為模板，結(jié)合MLST基因分型的方法，通過(guò)使用7個(gè)保守基因引物 (ace、ghmD、gltB、lipA、lepA、nark、ndh) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)[5-6]，將擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行基因測(cè)序，再將測(cè)序結(jié)果在http://pubmlst.org/網(wǎng)站上進(jìn)行管家基因序列對(duì)比，再利用e-BURST軟件對(duì)該高致病性細(xì)菌進(jìn)行溯源性分析，結(jié)果證實(shí)該高致病性細(xì)菌為ST393型類鼻疽伯克霍爾德菌。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株與2015年澳大利亞籍旅游者感染的類鼻疽伯克霍爾德菌為相同的ST型，且傳染源均來(lái)自泰國(guó)[7]。此外，該ST型別與中國(guó)本土發(fā)現(xiàn)的類鼻疽伯克霍爾德菌BPC006(ST70)親緣性關(guān)系較遠(yuǎn)，再結(jié)合患者1個(gè)月前有去泰國(guó)旅游的經(jīng)歷，可判定該細(xì)菌為1例輸入性的類鼻疽伯克霍爾德菌。該高致病性類鼻疽伯克霍爾德菌MLST基因分型的結(jié)果見圖2。

圖1 API 20NE生化鑒定系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果

圖2 類鼻疽伯克霍爾德菌MLST基因分型 (e-BURST)

4 討 論

通過(guò)對(duì)1例高致病性類鼻疽伯克霍爾德菌進(jìn)行鑒定和溯源性分析，得到了很多重要的結(jié)論。近年來(lái)，隨著旅游業(yè)的不斷發(fā)展，世界范圍內(nèi)輸入性類鼻疽病例的報(bào)道已屢見不鮮[8-10]。類鼻疽的流行和傳播也日益廣泛，已經(jīng)不再是單純的熱帶地區(qū)流行病，它可通過(guò)去疫區(qū)后攜帶感染而發(fā)病。這不僅給全球醫(yī)療衛(wèi)生應(yīng)急工作提出了新的挑戰(zhàn)，同時(shí)也給未來(lái)類鼻疽研究和診斷提出了新的要求。類鼻疽伯克霍爾德菌是一種人畜共患的高致病性細(xì)菌，它主要存在于熱帶地區(qū)的土壤和水中。泥土和水是類鼻疽的主要傳染源，經(jīng)常與泥土和水打交道的農(nóng)民、漁民等都是其感染的主要對(duì)象，另外糖尿病等引起免疫功能低下者也容易感染類鼻疽伯克霍爾德菌[11-12]。在類鼻疽發(fā)病的初期，可出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱、頭痛、咳嗽、咳痰、胸痛、腹痛、尿頻、尿急、尿痛、骨關(guān)節(jié)疼痛等一些非特異性表現(xiàn)，極易被誤診為其他疾病。慢性患者常表現(xiàn)為局部化膿性感染，臨床治療比較困難；急性感染患者病情進(jìn)展急進(jìn)兇險(xiǎn)，短期內(nèi)即可迅速發(fā)展為急性肺炎、急性敗血癥同時(shí)可伴有多器官化膿性損害，如治療不及時(shí)，極易導(dǎo)致多器官功能衰竭而死亡。而本例患者剛開始也出現(xiàn)不明原因發(fā)熱，并且高燒持續(xù)不退而入院，患者入院后，醫(yī)生剛開始經(jīng)驗(yàn)性使用阿莫西林克拉維酸鉀治療，病情未見好轉(zhuǎn)，待血培養(yǎng)和尿液培養(yǎng)細(xì)菌鑒定結(jié)果均提示類鼻疽伯克霍爾德菌時(shí)，課題組與專家組共同商討后決定按照類鼻疽治療方案 (靜脈滴注泰能) 進(jìn)行治療，病情便迅速得以控制，為后期順利康復(fù)出院提供了有力保證。此外，治療期間，醫(yī)院對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性隔離治療，未出現(xiàn)類鼻疽院內(nèi)感染病例。

本研究采用Vitek-2 Compact GN鑒定卡、MALDI-TOF MS、API 20NE生化鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因序列分析等方法對(duì)臨床分離的一株高致病性類鼻疽伯克霍爾德菌進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定，并通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查分析和MLST分型等方法對(duì)該高致病性類鼻疽伯克霍爾德菌進(jìn)行了溯源性分析，結(jié)合相關(guān)研究確定為1例輸入性類鼻疽病例。因此，通過(guò)對(duì)該病例的研究報(bào)道，提示臨床醫(yī)生應(yīng)加強(qiáng)對(duì)類鼻疽伯克霍爾德菌的監(jiān)測(cè)，更加清楚地知曉該菌的分子流行病學(xué)情況，同時(shí)醫(yī)療防疫人員應(yīng)提高警惕，加強(qiáng)該病種防控。