類鼻疽伯克霍爾德菌致病及耐藥機制

梁海云，李 琪，2，3，黃莉雅，王麗芳，周向東，2，3

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 海口 570102；2.海南醫(yī)學(xué)院國家衛(wèi)健委熱帶病防治重點實驗室，海南 ?？?70102；3.海南省呼吸疾病中心，海南 ?？?570100）

類鼻疽是由類鼻疽伯克霍爾德菌（Burkholderia pseudomallei）感染所致的傳染病，是人獸共患病，發(fā)病區(qū)域一般都在北緯20°至南緯20°之間，在我國主要分布在海南、廣西、廣東、福建等地［1，2］。主要因接觸污染的土壤或水而感染，皮膚接觸和吸入為主要的感染途徑，也可經(jīng)過母親的母乳傳播給嬰兒［3］。本病一般散發(fā)，無明顯季節(jié)性，但在雨季、洪澇及臺風(fēng)天發(fā)病率較高［4，5］。人群普遍易感，其中與土地接觸多的農(nóng)民、糖尿病患者、免疫力低下者發(fā)病率高，其中2 型糖尿病已證實是類鼻疽的獨立危險因素［6］。

類鼻疽感染的患者無特異性臨床表現(xiàn)，感染可累及多個系統(tǒng)，故又稱“似百樣病”（great mimicker），85%導(dǎo)致急性感染，11%導(dǎo)致持續(xù)數(shù)月至數(shù)年的慢性感染，而5%導(dǎo)致隱匿性感染。急性感染以類鼻疽肺炎、類鼻疽敗血病較為常見，多伴有全身多臟器膿腫（脾臟75%、肝臟45%），重癥患者常并發(fā)膿毒血癥、膿毒性休克［7］。其中肺部感染的影像學(xué)改變與空洞性肺結(jié)核、肺膿腫、高毒力肺炎克雷伯桿菌所致肺炎類似［8］，非疫源地區(qū)早期漏診誤診率高，類鼻疽伯克霍爾德菌的天然耐藥機制及免疫逃逸使其對多種抗生素耐藥［9］，病情進(jìn)展迅速。

因類鼻疽上述特征，充分認(rèn)識類鼻疽菌研究其致病機制及耐藥機制尤為重要。本文探討類鼻疽伯克霍爾德菌的致病機制及耐藥機制，以期為疾病診斷、治療以及疫苗的研究提供思路。

1 類鼻疽菌胞外運動的機制

類鼻疽伯克霍爾德菌是土壤腐生菌，為革蘭染色陰性、機會性、兼性胞內(nèi)寄生菌。有鞭毛，無芽胞，無莢膜，需氧，在普通培養(yǎng)基上生長良好［10］。Thomas 等［11］在模型小鼠上進(jìn)行類鼻疽定殖實驗，發(fā)現(xiàn)小液滴（1 μm）中的細(xì)菌定殖于下呼吸道上皮，而大液滴（12 μm）中的細(xì)菌主要與鼻黏膜和鼻相關(guān)淋巴組織（NALT）有關(guān)。但無論最初的定植部位如何，類鼻疽菌的感染在72 h 內(nèi)迅速在全身擴散，遠(yuǎn)端器官可見定植。而類鼻疽在宿主細(xì)胞外游走及黏附在宿主細(xì)胞主要依賴以下結(jié)構(gòu)：

1.1 鞭毛

細(xì)菌的鞭毛不僅允許細(xì)菌在環(huán)境中移動，而且在許多物種中，它是入侵宿主細(xì)胞所必需的。類鼻疽菌的鞭毛蛋白亞基由fliC 編碼（BPSL3319）。該基因的缺失或失活在實驗中導(dǎo)致了非運動性菌株［12-15］。Inglis 等［16］發(fā)現(xiàn)缺乏鞭毛的類鼻疽菌的突變菌株無法附著在棘阿米巴的滋養(yǎng)體上，考慮鞭毛使類鼻疽菌可早期黏附在細(xì)胞上。并且可能起到天然性抗原的作用。

1.2 Ⅳ型菌毛

Ⅳ型菌毛因其黏附作用，是大多數(shù)革蘭陰性桿菌的重要毒力因子，是細(xì)菌初期黏附宿主細(xì)胞的先決條件。當(dāng)類鼻疽菌到達(dá)宿主細(xì)胞膜表面，其Ⅳ型菌毛通過絲聚合和解聚合收縮和伸展［17］，沿著表面移動并與宿主細(xì)胞密切接觸，與宿主上皮細(xì)胞結(jié)合起到黏附作用［18］。這導(dǎo)致了類鼻疽菌可以感染全身多處臟器。Ⅳ型菌毛的特殊結(jié)構(gòu)蛋白 PliA，當(dāng)類鼻疽菌缺失了 PliA，細(xì)菌對宿主細(xì)胞的黏附、損傷作用明顯降低［18］。

2 類鼻疽菌的毒力因子

2.1 BimA

類鼻疽菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)運動，以宿主肌動蛋白為媒介進(jìn)行。胞內(nèi)動力相關(guān)蛋白（BimA），是類鼻疽菌分泌的肌動蛋白。類鼻疽菌粘附在宿主細(xì)胞后分泌BimA，BimA 誘導(dǎo)宿主肌動蛋白聚集，使細(xì)菌穿過細(xì)胞膜到達(dá)胞內(nèi)［19］。誘導(dǎo)形成的肌動蛋白絲讓類鼻疽菌可以在胞內(nèi)移動，同時形成以肌動蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞膜突出結(jié)構(gòu)，使類鼻疽菌可在細(xì)胞間移動，并感染其他細(xì)胞，促成了多核巨細(xì)胞（multi-nucleatedgiantcells，MNGC）的形成，類鼻疽菌在胞內(nèi)的生存空間變大，同時可逃避機體免疫細(xì)胞的吞噬，并全身擴散［20，21］。同時，BimA 被證實與肺炎的發(fā)生有關(guān)，BimA 基因的變異，即BimABm變異，與類鼻疽腦脊髓炎發(fā)病有關(guān)，亞洲菌株中尚未發(fā)現(xiàn)此類變異，該地區(qū)腦脊髓炎發(fā)病率低。

2.2 Ⅲ型分泌系統(tǒng)

Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲ secretion system，T3SS），是由多種蛋白質(zhì)分子組成的一個復(fù)合結(jié)構(gòu)，類鼻疽菌已知有3 套T3SS，其中僅T3SS-3 為主要有效成分［22］。T3SS 的主要作用是，在類鼻疽菌粘附在宿主細(xì)胞后，可誘導(dǎo)宿主肌動蛋白重排，使細(xì)菌可以快速逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，主導(dǎo)了類鼻疽菌在宿主細(xì)胞的吞噬逃逸。T3SS 可分泌一種特殊的效應(yīng)蛋白-BopC，Gong 等［23］的實驗證明BopC 的失活會導(dǎo)致吞噬體中的細(xì)菌存活減少［24］。

2.3 Ⅵ型分泌系統(tǒng)

Ⅵ 型分泌系統(tǒng)（type Ⅵ secretion system，T6SS），是廣泛存在于革蘭氏陰性菌中的一種細(xì)菌分泌系統(tǒng)［25］。在類鼻疽伯克霍爾德菌的T6SS 命名為 tss-5［26］。T6SS 是一個多基因編碼的多分子復(fù)合物，由膜復(fù)合物、基板復(fù)合物、噬菌體樣結(jié)構(gòu)組成。噬菌體樣結(jié)構(gòu)中的纈氨酸-甘氨酸重蛋白G（VgrG）、溶血素調(diào)節(jié)蛋白（Hcp）起到關(guān)鍵作用［27］。當(dāng)T6SS 被激活，噬菌體中的VgrG，可穿破細(xì)胞膜，并釋放多種效應(yīng)蛋白；效應(yīng)蛋白及其他小分子的毒力，通過Hcp 直接進(jìn)入靶細(xì)胞中，可導(dǎo)致細(xì)胞膜空泡化，抑制細(xì)胞生長，破壞細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)［28］。

T6SS 在促進(jìn)MNGC 形成中也起到關(guān)鍵作用，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)類鼻疽菌喪失了Hcp、VgrG 后，無法形成MNGC，無法進(jìn)行細(xì)胞融合［29，30］。缺乏T6SS，導(dǎo)致類鼻疽菌在細(xì)胞間傳播減少，是類鼻疽菌重要的毒力因子。

2.4 莢膜多糖（CPS）

在鏡下觀察類鼻疽菌生長時，可見細(xì)菌外部附有一層呈放射性生長的絲狀物，這是類鼻疽菌的莢膜多糖，研究表明莢膜多糖可保護(hù)類鼻疽菌，使其不被吞噬細(xì)菌吞噬，主要是莢膜多糖有抗溶菌酶體作用［31］。已知類鼻疽菌可潛伏感染幾個月甚至數(shù)年之久，這可能是導(dǎo)致類鼻疽菌潛伏感染的機制［32］。

2.5 類鼻疽伯克霍爾德致死因子1

類鼻疽伯克霍爾德致死因子1（burkholderia lethal factor 1，BLF1），是類鼻疽菌第一個被發(fā)現(xiàn)的致死因子，使宿主細(xì)胞失去mRNA 的解旋酶活性，抑制蛋白質(zhì)的翻譯起始階段，蛋白質(zhì)的合成受到抑制，細(xì)胞受損失去活性［32，33］。

3 耐藥機制

類鼻疽菌擁有最大的細(xì)菌基因組之一（7.2 Mb），包含大量毒力決定因子［34］，使其臨床表現(xiàn)多樣化，缺乏特異性，對其耐藥機制的研究進(jìn)展困難。現(xiàn)已知，類鼻疽菌有天然耐藥機制，對臨床上多種常見抗生素如喹諾酮類、一代及二代頭孢、青霉素類等耐藥。實驗條件下，可見類鼻疽菌對頭孢他啶、碳青霉烯類抗生素等敏感，隨著診療時間的延長，抗生素選擇不當(dāng)，可導(dǎo)致類鼻疽菌對四環(huán)素等的耐藥性增加。其中，頭孢他啶作為類鼻疽菌首選用藥［35］，早期一線使用可讓患者臨床癥狀明顯減輕，這可作為與高毒力肺炎克雷伯桿菌所致肺炎相鑒別要點。目前類鼻疽伯克霍爾德菌耐藥機制尚未明確，可能與外排泵、抗生素靶位點的改變有關(guān)［36，37］。

3.1 外排泵

細(xì)菌的外排作用是產(chǎn)生耐藥性的重要機制，外排系統(tǒng)目前被劃分為六個超級家族，其中類鼻疽細(xì)胞 膜 上 存 在 3 個 外 排 泵 AmrAB-OprA，BpeAB-OprB，and BpeEF-OprC，均為RND（耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族）型外排泵［38，39］。外排泵通過改變其自身的調(diào)節(jié)因子，使類鼻疽菌對某種類型抗生素產(chǎn)生耐藥，amrA 和amrB 基因是AmrAB-OprA的重要組成基因，AmrAB-OprA 可使氨基糖苷類藥物及大環(huán)內(nèi)酯類藥物外排［40］。其余外排泵耐藥機制尚未研究清楚。

3.2 抗生素靶位點改變及其他

在Shafiq 等［41］的研究中，從2018～2019 年廣東省獲得了8 株類鼻疽菌臨床分離株，采用Illumina NovaSeq 平臺測序，多位點序列分型（MLST）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析，分析菌株的多樣性和流行病學(xué)特征。實驗得出類鼻疽菌對頭孢他啶的耐藥性可能是由A 類β-內(nèi)酰胺酶PenA（編碼高度保守的A 類β-內(nèi)酰胺酶的基因）的突變引起；外膜蛋白Omp38，是類鼻疽菌細(xì)胞膜外膜上的一種孔道蛋白，參與編碼類鼻疽菌的外膜孔，外層膜孔的結(jié)構(gòu)降低類鼻疽菌對β-內(nèi)酰胺的滲透性；在所有菌株中均發(fā)現(xiàn)了基因gyrA，Viktorov 等研究證實gyrA 的突變是導(dǎo)致喹諾酮類藥物耐藥的原因。

4 討論

以上是類鼻疽菌的致病及耐藥機制，類鼻疽菌慢性潛伏及急性起病的方式，于宿主之間關(guān)系仍有待驗證。目前相關(guān)研究顯示，類鼻疽菌在宿主細(xì)胞中長期存活可能與類鼻疽菌可引起宿主細(xì)胞自噬有關(guān)。夏瑀培等［42］通過實驗將類鼻疽菌感染THP-1 細(xì)胞后，在感染2 h 后觀察宿主細(xì)胞線粒體受損情況，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)感染后的宿主細(xì)胞線粒體，自噬小體GFP-LC3 共定位明顯增多（P＜0.01），提示類鼻疽菌感染后，誘導(dǎo)了宿主細(xì)胞線粒體自噬的發(fā)生。如何阻止上述機制發(fā)生，仍有待進(jìn)一步研究。

從類鼻疽菌初次發(fā)現(xiàn)至今，尚未能明確其感染以及耐藥的機制，隨交通方式的便捷化，非疫區(qū)發(fā)病率在逐漸升高，因缺乏對該細(xì)菌的認(rèn)知，誤診率隨之上升［2］。其中針對T6SS 中的結(jié)構(gòu)，溶血素調(diào)節(jié)蛋白（Hcp）特異性的IgG 抗體檢測，是目前重要的早期篩查指標(biāo)［43］。雖然 Hcp1 特異性的IgG 抗體檢測，是重要靶標(biāo)，但 在感染早期、重度感染、免疫力低下人群中易出現(xiàn)假陰性［44］。二代及三代細(xì)菌基因測序手段（NGS）等提高了類鼻疽病確診率［45］。臨床采集標(biāo)本中，以肺泡灌洗液陽性率高。

借此綜述，對當(dāng)前類鼻疽菌的致病及耐藥機制進(jìn)行論述。未來對類鼻疽菌的診治及研究展望：（1）利用NGS 等測序手段，較快速明確診斷。宏基因二代測序（mNGS），在早期可快速明確感染病原體，并進(jìn)行耐藥檢測［46］。（2）采用宏基因組學(xué)的方式，可更全面的挖掘細(xì)菌的新型基因組學(xué)，進(jìn)一步的抗菌藥物佐劑研發(fā)。（3）針對類鼻疽菌可導(dǎo)致免疫逃逸的T3SS、T6SS、BimA 等機制，是否可進(jìn)行進(jìn)一步的干擾及疫苗的研究。（4）莢膜多糖的溶菌酶作用可能是導(dǎo)致類鼻疽菌潛伏感染的機制，可進(jìn)一步進(jìn)行針對該結(jié)構(gòu)的分子探針的研究，已期進(jìn)行疾病的初篩。（5）臨床上可見類鼻疽合并鐵超載的情況，似乎與類鼻疽的發(fā)病率增加有關(guān)，可能表明鐵在發(fā)病機制中起著比已知的更重要的作用，可針對此進(jìn)行更進(jìn)一步研究。