鈣對(duì)人系膜細(xì)胞增殖及1,25-D3-MARRS蛋白表達(dá)的影響

任國(guó)臣，劉 剛，趙 丹，顧 杰，楊曉萍

系膜細(xì)胞為腎臟固有細(xì)胞，其異常增殖是原發(fā)性腎小球腎炎向終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。研究[1-2]顯示，系膜細(xì)胞的增殖可以受1,25(OH)2D3和鈣的調(diào)節(jié)， 其中1,25(OH)2D3對(duì)靶細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制可分為兩種，即通過(guò)核受體(nVDR)的基因組機(jī)制和膜受體(1,25-D3-MARRS)的非基因組機(jī)制[3]。有研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3和鈣可通過(guò)調(diào)節(jié)nVDR的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[4]，而近期人們對(duì)于人系膜細(xì)胞中有沒(méi)有nVDR的表達(dá)說(shuō)法并不一致[5-6]，課題組前期已證實(shí)：1,25(OH)2D3可以抑制系膜細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]，但其是否是通過(guò)活化維生素D受體來(lái)發(fā)揮作用，以及鈣對(duì)該過(guò)程的調(diào)節(jié)作用不得而知。1,25(OH)2D3和鈣是否可以通過(guò)非基因組機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用，而鈣是否可以通過(guò)單獨(dú)影響1,25-D3-MARRS的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞的增殖也尚無(wú)研究。該研究通過(guò)觀察不同濃度鈣離子對(duì)人系膜細(xì)胞增殖及對(duì)1,25-D3-MARRS表達(dá)的影響，進(jìn)而探討鈣對(duì)人系膜細(xì)胞作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器CCK-8試劑盒(上海同仁化學(xué)研究所);氯化鈣(上海生工生物公司);低糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清 (FBS，以色列BI公司);小鼠抗人ERP57單克隆抗體(美國(guó)Santa公司,B-5);山羊抗小鼠IgG FITC、山羊抗小鼠IgG二抗(中國(guó)北京中杉金橋公司);激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞株由湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基復(fù)蘇系膜細(xì)胞，置于5%CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物干預(yù)及分組按實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃?組：正常對(duì)照組(含5% FBS DMEM培養(yǎng)基)、低鈣組(含10-4mol/L氯化鈣的DMEM培養(yǎng)基)、高鈣組(含1.8×10-3mol/L氯化鈣的DMEM培養(yǎng)基)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況取系膜細(xì)胞接種于96孔板，藥物干預(yù)后于培養(yǎng)箱中孵育48 h,干預(yù)時(shí)間結(jié)束前4 h吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入含CCK-8溶液(10 μl/孔)的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1～4 h,酶標(biāo)儀測(cè)定各孔于450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑制率(inhibition rate，IR)=(Ac對(duì)照組值-As實(shí)驗(yàn)組值)/(Ac對(duì)照組值-Ab空白組值)×100%。

1.5 免疫熒光染色法檢測(cè)1,25-D3-MARRS蛋白的定位及半定量表達(dá)取藥物干預(yù)48 h后已爬片系膜細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，5% BSA封閉30 min，小鼠抗人ERP57單克隆抗體(1,25-D3-MARRS)(1 ∶50)孵育，4 ℃過(guò)夜，山羊抗小鼠IgG FITC(1 ∶100)室溫孵育1 h，1×PBS洗3次，PI染色，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦采圖、AIM軟件測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)1,25-D3-MARRS的mRNA含量取干預(yù)48 h后各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。1,25-D3-MARRS上游引物序列為：5′-CTGAGCTAGCCGCAAAACC-3′，下游引物：5′-CAGAGCCTTCCCATCACG-3′; β-actin上游引物序列為：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游引物：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。按照試劑盒說(shuō)明書，PCR總反應(yīng)體積為20 μl，42 ℃、60 min行反轉(zhuǎn)錄，70 ℃、5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃、30 s，60 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。記錄每個(gè)目的基因擴(kuò)增的Ct閾值，以相應(yīng)的β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western blot法檢測(cè)1,25-D3-MARRS蛋白的表達(dá)取藥物干預(yù)48 h各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液(RIPA:PMSF=100 ∶10)裂解細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書分別提取總蛋白，煮沸使蛋白變性。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，ERP57單克隆抗體(1 ∶100)作為目的蛋白，β-actin(1 ∶1 000)作為內(nèi)參，4 ℃過(guò)夜。山羊抗小鼠二抗(1 ∶10 000) 37 ℃孵育2 h，洗膜后顯色，暗室內(nèi)膠片曝光。采圖后Gel-pro軟件圖像數(shù)據(jù)分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較不同濃度鈣離子干預(yù)系膜細(xì)胞48 h后，CCK-8法檢測(cè)正常對(duì)照組、低鈣組、高鈣組OD值，分別為：(1.574 4±0.063 8)、1.235 4±0.044 9)、(1.699 6±0.056 5)。與正常對(duì)照組相比，低鈣組OD值較高，高鈣組OD值較低；與低鈣組相比，高鈣組OD值較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.65，P<0.01)。抑制率：低鈣組抑制率(21.5%)顯著高于正常對(duì)照組，高鈣組(-7.9%)低于正常對(duì)照組，提示低濃度鈣離子(10-4mol/L)可顯著抑制系膜細(xì)胞的增殖，高濃度鈣離子(1.8×10-3mol/L)可以促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖。

2.2 各組1,25-D3-MARRS蛋白的定位及熒光強(qiáng)度比較各組1,25-D3-MARRS蛋白均以胞膜表達(dá)為主，部分表達(dá)在胞質(zhì)及胞核，見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組、低鈣組、高鈣組1,25-D3-MARRS蛋白的表達(dá)量分別為：(29.97±8.625 1)、(59.93±3.521 5)、(12.09±0.605 3)。與正常對(duì)照組比較，低鈣組蛋白表達(dá)量較高；與低鈣組比較，高鈣組蛋白表達(dá)量較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.6，P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，高鈣組蛋白表達(dá)量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 1,25-D3-MARRS蛋白的定位表達(dá) ×200

A：正常對(duì)照組；B：低鈣組；C：高鈣組； 箭頭所指：1,25-D3-MARRS蛋白表達(dá)部位

2.3 各組1,25-D3-MARRS mRNA含量比較不同濃度鈣離子干預(yù)后，正常對(duì)照組、低鈣組、高鈣組系膜細(xì)胞的1,25-D3-MARRS mRNA含量分別為：(1.00±0.00)、(3.699 6±0.713 2)、(0.922 1±0.188 0)。與正常對(duì)照組比較，低鈣組1,25-D3-MARRS mRNA含量較高，與低鈣組比較，高鈣組含量較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.795，P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，高鈣組含量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組1,25-D3-MARRS蛋白表達(dá)量比較與正常對(duì)照組比較，低鈣組蛋白表達(dá)較高；與低鈣組比較，高鈣組蛋白表達(dá)較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.65，P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，高鈣組蛋白表達(dá)量降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

3 討論

慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)的患病率逐年升高，帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)壓力和嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，并最終可發(fā)展為ESRD。在我國(guó)，導(dǎo)致ESRD的主要病因是原發(fā)性腎小球疾病，其中又以系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)最為常見(jiàn)。該病的主要病理改變是系膜細(xì)胞異常增殖和系膜基質(zhì)增多，繼而導(dǎo)致小球硬化及間質(zhì)纖維化，最終引起ESRD[7]。因此尋求逆轉(zhuǎn)或緩解系膜細(xì)胞異常增殖的方法具有重要意義。

圖2 各組系膜細(xì)胞1,25-D3-MARRS蛋白的表達(dá)

A：正常對(duì)照組；B：低鈣組；C：高鈣組；與正常對(duì)照組比較：*P<0.05; 與低鈣組比較：#P<0.05

鈣參與了腎小球系膜細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄等多種重要過(guò)程[8]。而慢性腎臟病患者早期便可出現(xiàn)鈣磷代謝的紊亂，故糾正其紊亂在慢性腎臟病發(fā)展的進(jìn)程中具有重要意義[9]。研究[10]表明細(xì)胞內(nèi)外Ca2+水平的變化與系膜細(xì)胞的增殖有關(guān)，細(xì)胞外不同濃度的Ca2+所發(fā)揮的作用不同，細(xì)胞外高鈣狀態(tài)可以激活細(xì)胞表面蛋白鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)，通過(guò)人系膜細(xì)胞中的TRPC3和TRPC6通道介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞增殖。典型的生理Ca2+水平是接近1.3×10-3mol/L，遠(yuǎn)低于CaSR活化所需的濃度。因此，本研究選取10-4mol/L和1.8×10-3mol/L的Ca2+濃度分別作為低鈣和高鈣的條件[11]。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：高鈣具有促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖的作用，而低鈣可以抑制其增殖。從而驗(yàn)證該濃度的Ca2+可用于對(duì)系膜細(xì)胞增殖作用的研究。此外推測(cè)，高濃度Ca2+可通過(guò)使CaSR活化來(lái)介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，而低濃度Ca2+未能使CaSR活化，對(duì)系膜細(xì)胞的增殖出現(xiàn)了抑制作用，為進(jìn)一步的研究提供理論基礎(chǔ)。

1,25-D3-MARRS結(jié)合蛋白是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，與ERP57、GRP60同源，均屬于二硫異構(gòu)蛋白酶3(PDIA3)蛋白家族，是活性維生素D3發(fā)揮作用的非基因組機(jī)制[4]。近期研究[12]顯示，1,25-D3-MARRS/ERp57不僅可以促進(jìn)小腸對(duì)鈣磷的快速吸收作用，在多種腫瘤組織中的異常表達(dá)也與抑制腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。1,25(OH)2D3可與細(xì)胞膜表面的1,25-D3-MARRS /ERp57結(jié)合后，先后激活磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)，最終導(dǎo)致PLC釋放。研究[8]表明，Ca2+是系膜細(xì)胞中PLA2活性的重要生理調(diào)節(jié)劑，Ca2+在生理范圍(10-4～10-3mol/L)內(nèi)增加時(shí)，可增強(qiáng)PLA2活性，因此推測(cè)，Ca2+在生理范圍內(nèi)的增加可抑制系膜細(xì)胞的增殖，但其是否與活性維生素D膜相關(guān)快速反應(yīng)結(jié)合蛋白1,25-D3-MARRS有關(guān)尚不明了。

既往研究顯示，1,25(OH)2D3通過(guò)與1,25-D3-MARRS蛋白結(jié)合發(fā)揮的非基因組機(jī)制需要Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II(CaMKII)的調(diào)節(jié)[13]，該蛋白的表達(dá)與caspase-3的激活等凋亡進(jìn)程也密切相關(guān)[14]。眾多研究表明，1,25-D3-MARRS蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)需要鈣的參與。本研究顯示，在各組人系膜細(xì)胞的胞膜、胞核及胞質(zhì)中均有1,25-D3-MARRS蛋白的表達(dá)，且主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，這與既往研究[3,15]相符。通過(guò)觀察1,25-D3-MARRS蛋白定量的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，低鈣作用下1,25-D3-MARRS的表達(dá)升高;高鈣作用下1,25-D3-MARRS的表達(dá)降低，mRNA水平也是如此，結(jié)合CCK-8結(jié)果提示：隨著系膜細(xì)胞抑制率的增加，1,25-D3-MARRS蛋白表達(dá)升高，由此推測(cè)，低濃度Ca2+可能是通過(guò)促進(jìn)1,25-D3-MARRS蛋白的表達(dá)來(lái)抑制系膜細(xì)胞的增殖，而高濃度Ca2+相反，但該結(jié)論仍需進(jìn)一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，低濃度鈣可能是通過(guò)上調(diào)1,25-D3-MARRS蛋白的表達(dá)來(lái)抑制人腎小球系膜細(xì)胞的增殖，而高濃度鈣是否可以隨著濃度變化調(diào)節(jié)1,25-D3-MARRS的表達(dá)尚待研究，鈣對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控也受多種因素的影響，如細(xì)胞類型、胞外刺激的濃度及持續(xù)時(shí)間、不同的凋亡信號(hào)通路等，因此該結(jié)論仍需更多的干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。若該結(jié)論得到進(jìn)一步證實(shí)，或成為阻礙慢性腎臟病病程進(jìn)展的重要靶點(diǎn)。通過(guò)分子靶向藥物上調(diào)1,25-D3-MARRS蛋白的表達(dá)來(lái)抑制系膜細(xì)胞的增殖，從而可能阻礙腎小球腎炎的進(jìn)一步發(fā)展。