糞便潛血試驗(yàn)及糞便DNA檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌篩查的比較研究

金 水，王亞雷，衡 苗，李仁君，路 亮，朱道明，方海明

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的發(fā)病率在女性中僅次于乳腺癌(35.3%)，占新癌癥病例的13.4%；在男性三大常見癌癥中排第3，分別為前列腺癌(27.0%)、肺癌(16.6%)和CRC(13.8%)[1]；每年約有140萬新病例和70萬死亡病例[2]。

CRC患者的存活率主要與診斷時(shí)的癌癥分期有關(guān)[3]。說明應(yīng)該尋找有效的防治策略，但目前中國(guó)缺乏CRC的準(zhǔn)確篩查方法。腸鏡檢查及病理結(jié)果是CRC診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]，但腸鏡檢查因其侵入性、腸道準(zhǔn)備以及患者的恐懼心理，造成依從性很差[5]。結(jié)直腸腺瘤和癌性病變會(huì)出血，糞便潛血試驗(yàn)可檢測(cè)到，通常采用糞便潛血試驗(yàn)對(duì)CRC高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行初步篩查[6]。因此，該研究就目前常用的糞便潛血檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比研究，評(píng)估其對(duì)結(jié)直腸病變的診斷差異。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2018年5～11月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院消化內(nèi)科和胃腸外科門診及住院、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院以及安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科門診及住院的244例患者作為研究對(duì)象，均進(jìn)行結(jié)直腸鏡檢測(cè)，年齡在50～75(64±5)歲。標(biāo)本為腸道準(zhǔn)備前的糞便。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 拒絕參與試驗(yàn)者；② 明顯血便、柏油便者；③ 合并齒衄、鼻衄者；④ 月經(jīng)中者；⑤ 肛裂、痔瘡者；⑥ 有持續(xù)性腸梗阻等癥狀者；⑦ 其他原因致消化道出血者(胃潰瘍、胃癌等)。本研究由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：PJ2018-05-19，口頭說明并簽署了知情同意書。

1.2 研究方法數(shù)值化法采用OC-易友全自動(dòng)便潛血分析儀專用采便器留取1份標(biāo)本，放入冰箱冷藏，1周內(nèi)進(jìn)行數(shù)值化檢測(cè)；數(shù)值化免疫法聯(lián)合糞便DNA檢測(cè)法(fecal immunochemical test and DNA,FIT-DNA)，用專用采便器加入糞便標(biāo)本混勻后常溫保存，5 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)；膠體金法采用常規(guī)采便器留取1份標(biāo)本，在2 h內(nèi)送檢驗(yàn)科檢測(cè)；噗噗管采取糞便標(biāo)本，5～10 min內(nèi)根據(jù)顯示結(jié)果判斷陰性、陽(yáng)性。對(duì)于結(jié)直腸腺瘤，根據(jù)中國(guó)早期CRC及癌前病變篩查與診治共識(shí)(2014年重慶)[7]和2016年美國(guó)《結(jié)直腸息肉切除術(shù)后隨訪指南》[8]指出高危腺瘤應(yīng)具備以下條件之一：數(shù)目在3個(gè)或以上；腺瘤直徑≥ 1 cm；絨毛狀腺瘤或高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。排除標(biāo)準(zhǔn)：家族性腺瘤性息肉病、炎癥性腸病、CRC病史、黑斑息肉綜合征及息肉-色素沉著-脫發(fā)-爪甲營(yíng)養(yǎng)不良綜合征及腺瘤未能切除完全者等。

1.3 儀器免疫膠體金法采用成都沃文特生物技術(shù)有限公司提供的便隱血膠體金檢測(cè)卡(20152400061)定性糞便血紅蛋白。數(shù)值化法采用日本榮研公司的OC-易友全自動(dòng)便潛血分析儀(OC-SENSOR io)及其配套試劑定量血紅蛋白，按照血紅蛋白濃度高于100 ng/ml為陽(yáng)性。自測(cè)型免疫膠體金法糞便潛血檢測(cè)-噗噗管(杭州諾輝健康科技有限公司)是采用即時(shí)免疫化學(xué)雙抗體夾心法定性糞便血紅蛋白測(cè)定技術(shù)，噗噗管可明顯提升CRC和進(jìn)展期腺瘤的診斷敏感性和特異性。5～10 min內(nèi)出結(jié)果，通過與說明書比對(duì)顯色條帶位置判斷是否消化道出血(隱血)及相關(guān)疾病。FIT-DNA法采用杭州諾輝健康有限公司生產(chǎn)的常衛(wèi)清，是一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)人群位點(diǎn)特征，包含人糞便樣本中腸道脫落細(xì)胞內(nèi)的三類指標(biāo)(基因突變、基因甲基化和便隱血)的多靶點(diǎn)FIT-DNA聯(lián)合檢測(cè)服務(wù)技術(shù)。該技術(shù)利用PCR熒光探針法-膠體金法定性檢測(cè)人糞便樣本中的KRAS基因突變、BMP3和NDRG4基因甲基化及血紅蛋白然后將各個(gè)指標(biāo)檢測(cè)值通過配套軟件計(jì)算評(píng)分，閾值為165分，即1～164分為陰性，≥165為陽(yáng)性。在該項(xiàng)目中使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)腸鏡檢查采用日本奧林巴斯品牌(CV-260)，均由經(jīng)驗(yàn)豐富的消化內(nèi)科醫(yī)師在醫(yī)院進(jìn)行，所有患者均未出現(xiàn)腸道出血、穿孔等并發(fā)癥；腸道準(zhǔn)備:患者檢查前進(jìn)少渣或無渣飲食，當(dāng)天禁食早餐、午餐，上午口服瀉藥，為購(gòu)自上饒市恒康藥業(yè)有限公司的聚乙二醇電解質(zhì)散(H20020031)(配制：取A、B、C各1小包，同溶于1 000 ml溫水中成溶液，總用量為2 000 ml，首次服用600～1 000 ml，以后每隔10～15 min服用1次，每次250 ml，直至排出水樣清便)；無痛腸鏡檢查者使用靜脈推注丙泊酚中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液(J20160089，北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司)，劑量1.5～2.5 mg/kg進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，腸鏡結(jié)束后觀察30 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較4種不同檢測(cè)方法對(duì)CRC和癌前病變的診斷價(jià)值；方差不齊時(shí)選用非參數(shù)檢驗(yàn)；采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic, ROC)比較對(duì)癌前病變的預(yù)測(cè)效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者基本情況參與研究的244例患者中，男160例(65.6%)，女84例(34.4%)，年齡為50～75(64±6.5)歲，同時(shí)進(jìn)行4種篩查方法的有164例；同時(shí)行FIT-DNA、噗噗管法和數(shù)值化法篩查的有217例。

2.2 不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)直腸疾病的診斷價(jià)值分別計(jì)算不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)直腸疾病的陽(yáng)性率情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)IT-DNA對(duì)CRC和高危腺瘤性疾病的陽(yáng)性率均高于其他3種檢測(cè)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其對(duì)其他(炎癥性和非特異性腸炎腸病)和正常大腸的假陽(yáng)性率顯著低于其他3種檢測(cè)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3 不同檢測(cè)方法對(duì)高危腺瘤的診斷價(jià)值分別計(jì)算不同檢測(cè)方法對(duì)高危腺瘤的診斷情況，根據(jù)結(jié)果顯示，F(xiàn)IT-DNA檢測(cè)法在診斷高危腺瘤的敏感度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比均高于其他3種檢測(cè)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.4 不同檢測(cè)方法對(duì)CRC的診斷價(jià)值分析FIT-DNA檢測(cè)法在鑒別CRC時(shí)的敏感度高于免疫膠體金法、噗噗管檢測(cè)法和數(shù)值化免疫法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.5 數(shù)值化法和FIT-DNA法在腫瘤分期中的比較進(jìn)一步比較了手術(shù)治療患者的數(shù)值化法和FIT-DNA法中的數(shù)值，與腫瘤分期是否存在相關(guān)性。秩和檢驗(yàn)(方差不齊)顯示，兩種檢測(cè)方法中的數(shù)值在腫瘤各分期中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再根據(jù)中位數(shù)結(jié)果判斷，F(xiàn)IT-DNA法中的值明顯低于數(shù)值化法中的值，說明聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，較低的數(shù)值，即可對(duì)腫瘤分期做出準(zhǔn)確判斷，間接表明在聯(lián)合檢測(cè)法中，DNA檢測(cè)的加入提高了數(shù)值化法的敏感性。在數(shù)值化法中，數(shù)值與腫瘤分期之間存在明顯正相關(guān)性，腫瘤分期越高，數(shù)值越大；但是FIT-DNA法中，數(shù)值與腫瘤分期之間沒有相關(guān)性。見表4。

表1 不同檢測(cè)方法對(duì)大腸疾病的陽(yáng)性率情況

與其他三組比較：*P<0.05

表2 不同檢測(cè)方法對(duì)診斷高危腺瘤的差異比較

與其他三組比較：*P<0.05

表3 不同檢測(cè)方法對(duì)診斷CRC的差異比較

與其他三組比較：*P<0.05

表4 不同分期的數(shù)值化值和FIT-DNA值的秩和檢驗(yàn)

大腸癌Dukes分期：以腫瘤浸潤(rùn)的最大深度和是否伴發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為依據(jù)制定的Dukes腫瘤分期。

表5 不同檢測(cè)方法對(duì)診斷CRC和癌前病變的差異比較

與其他三組比較：*P<0.05

2.6 不同檢測(cè)方法對(duì)CRC及癌前病變?cè)\斷價(jià)值比較分析了不同檢測(cè)方法對(duì)診斷癌前病變及CRC的差異，結(jié)果顯示，F(xiàn)IT-DNA在診斷癌前病變及CRC的敏感度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比均高于其他3種檢測(cè)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

2.7 不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)腸癌及癌前病變的診斷效能比較進(jìn)一步做了ROC分析，見圖1，通過計(jì)算曲線下面積進(jìn)行比較各診斷工具對(duì)癌前病變的診斷效能。計(jì)算出ROC下面積等結(jié)果，見表6，根據(jù)結(jié)果可見：FIT-DNA法的診斷效能最大，數(shù)值化免疫法次之，噗噗管篩查方法的預(yù)測(cè)效能最差。進(jìn)一步證明了FIT-DNA檢測(cè)法對(duì)結(jié)直腸癌前病變的預(yù)測(cè)效能最優(yōu)。

3 討論

本課題首次報(bào)道了3種糞便潛血實(shí)驗(yàn)和FIT-DNA法在診斷CRC癌前病變、高危腺瘤以及腫瘤分期中的效能差異，以其為CRC早期防治工作、篩查工具選擇提供理論依據(jù)。從腺瘤進(jìn)展到CRC大約需要10年時(shí)間，對(duì)于早期病變，5年生存率可達(dá)到95%以上，但伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，5年生存率則低于10%，故對(duì)腺瘤的準(zhǔn)確檢測(cè)和早期切除可降低CRC的死亡率[9]。

圖1 不同檢測(cè)方法的ROC曲線圖

檢測(cè)方法面積標(biāo)準(zhǔn)差P值95%CI免疫膠體金0.6320.0440.0050.609～0.769噗噗管0.6020.0440.0300.515～0.688數(shù)值化0.6380.0440.0030.552～0.724FIT-DNA0.6890.0410.0000.609～0.769

數(shù)據(jù)顯示，如果對(duì)45歲以上的人進(jìn)行糞便潛血篩查，將有可能使CRC的死亡率降低60%[10]。然而目前國(guó)內(nèi)卻沒有基于大數(shù)據(jù)研究得出的CRC及癌前病變的篩查方案；而金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)直腸鏡檢查的依從性只有38%[11]，故急切需要一種簡(jiǎn)便、高效、價(jià)廉的檢測(cè)手段。目前國(guó)內(nèi)浙江大學(xué)鄭樹[12]團(tuán)隊(duì)在這一方面做出了突出貢獻(xiàn)，他們以CRC高危因素調(diào)查問卷結(jié)合糞便潛血實(shí)驗(yàn)為初步篩查，初篩結(jié)果為陽(yáng)性的進(jìn)一步行腸鏡檢查，在浙江的一些地區(qū)，已經(jīng)取得了不小的成果，明顯降低了CRC高發(fā)地區(qū)CRC的發(fā)病率和死亡率。

目前常用的糞便潛血檢測(cè)包括免疫膠體金法、數(shù)值化免疫法、噗噗管法和FIT-DNA法[13]；免疫膠體金法因?yàn)榫哂秀^狀效應(yīng)而漸趨淘汰，因安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院不再使用該方法，導(dǎo)致同時(shí)接受4種檢測(cè)方法的人數(shù)少于總研究人數(shù)[14]；現(xiàn)臨床檢驗(yàn)中普遍運(yùn)用數(shù)值化法，陽(yáng)性閾值設(shè)定為100 ng/ml[15]，本研究中，其敏感度和特異度僅次于FIT-DNA法，噗噗管法雖然操作便捷，但對(duì)結(jié)果的判斷帶有一定的主觀性。高薇[16]的研究表明免疫法診斷準(zhǔn)確率明顯高于化學(xué)法。

糞便DNA檢測(cè)技術(shù)是通過檢測(cè)糞便中腫瘤脫落細(xì)胞的DNA，從而得出有無癌前病變或腫瘤的結(jié)論[17]。Fearon et al[18]詳細(xì)地闡述了CRC的發(fā)生是由于腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白、原癌基因k-ras、抑癌基因p53等突變累積的結(jié)果。本研究使用FIT-DNA法，集潛血、基因突變、甲基化修飾為一體，閾值設(shè)為165，其敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比處于最佳狀態(tài)。張利 等[19]通過對(duì)鄭州5 000 例大樣本研究，得出糞便潛血聯(lián)合血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、癌胚抗原的檢測(cè)，對(duì)CRC篩查具有重要意義的結(jié)論。

我國(guó)人口基數(shù)大、疆域遼闊，醫(yī)療資源分配不均，由于患者對(duì)腸鏡的恐懼心理、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、侵入性、腸道準(zhǔn)備、不適感、身體條件限制、腸出血和腸穿孔風(fēng)險(xiǎn)等因素的影響，導(dǎo)致腸鏡的普及化及依從性提高存在諸多困難。由于潛血實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便易行，也極大提高了患者的依從性和減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，故具有不可替代的臨床篩查作用。

本研究表明，F(xiàn)IT-DNA檢測(cè)技術(shù)在人群概率性CRC、癌前病變、高危腺瘤篩查中，具有明顯優(yōu)勢(shì)。為FIT-DNA法在結(jié)直腸腫瘤篩查中的應(yīng)用可行性提供了理論基礎(chǔ)。本研究可能受樣本量、區(qū)域、性別比例差異影響而產(chǎn)生偏倚，故尚需多中心、大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。