1-磷酸鞘氨醇受體3調(diào)控RhoA/Rho激酶途徑影響糖尿病ED大鼠勃起功能的初步研究

文博 矯陽田 馮海航 李瑞 周炳炎 王濤 饒可

男性勃起功能障礙(erectile dysfunction， ED)是糖尿病患者常見的并發(fā)癥之一，具體表現(xiàn)為陰莖不能達到或者不能維持足夠的勃起硬度以完成滿意的性生活，約半數(shù)以上糖尿病患者最終會出現(xiàn)ED，發(fā)生率是普通人的3～4倍，其癥狀出現(xiàn)的時間較普通人早，程度也較其他類型ED患者嚴(yán)重，給糖尿病患者的生活帶來了極大的負(fù)擔(dān)[1-2]。

1-磷酸鞘氨醇受體(sphingosine-1-phospate receptor， S1PR)分布于人體的各個系統(tǒng)組織中，對生物體許多生理功能起著重要的保護作用[3-4]。S1PR1～S1PR3 3種受體是目前主要的研究對象。在人類陰莖海綿體組織中已經(jīng)證實了S1PR1～S1PR3的存在[5]，陰莖海綿體組織中S1PR與ED的關(guān)系也逐漸成為研究的熱點。目前研究發(fā)現(xiàn)S1PR1～S1PR3在雄激素缺乏、高血壓、海綿體神經(jīng)損傷等因素誘導(dǎo)的ED大鼠陰莖海綿體組織中的表達均不同于正常大鼠[6-8]。然而在Ⅰ型糖尿病誘導(dǎo)的大鼠ED模型中，S1PR3的表達情況及具體作用機制還未明確。本研究通過構(gòu)建Ⅰ型糖尿病ED大鼠模型，檢測S1PR3在糖尿病大鼠陰莖海綿體組織中表達水平的改變，探討S1PR3對Ⅰ型糖尿病誘導(dǎo)的ED大鼠勃起功能的作用機制。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：選取18只8周齡雄性大鼠，大鼠種類為Spragble-Dawley(SD)，體質(zhì)量控制在190～210 g，均為無特異病原(specific-pathogen-free, SPF)級別，所有實驗動物均來自湖北省疾病預(yù)防控制中心，動物許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。本研究所有動物實驗均按照國家實驗動物委員會操作規(guī)范認(rèn)真執(zhí)行，且在南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院實驗動物倫理委員會的監(jiān)督下完成。

2.主要試劑及儀器：鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)、檸檬酸、檸檬酸鈉(Sigma公司，美國)，1% STZ工作液：0.1 g STZ溶解到10 ml 0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.2)，現(xiàn)配現(xiàn)用；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(上海碧云天生物有限公司)；β-actin抗體、S1PR3抗體、PI3K抗體、AKT抗體、p-AKT抗體、羊抗兔和羊抗鼠二抗(Santa Cruz公司，美國)；羅氏血糖儀及試紙(ACCU-CHEK)；顯微鏡(江蘇蘇州六六視覺科技股份有限公司)；Powerlab四通道生理記錄儀(AD Instruments 公司，澳大利亞)。

二、實驗方法

1.Ⅰ型糖尿病大鼠模型建立：18只8周齡SPF級雄性SD大鼠在無菌環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨后將大鼠隨機分為2組，6只正常對照組予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)；其余12只大鼠，禁食不禁水12 h后腹腔注射65 mg/kg STZ。給藥之后禁水不禁食3～4 h，隨后同正常對照組常規(guī)飼養(yǎng)。STZ給藥72 h之后，檢測大鼠靜脈血糖，選取血糖值≥16.7 mmol/L的大鼠并做標(biāo)記，作為糖尿病大鼠，必要時STZ給藥后7 d復(fù)測血糖，糖尿病大鼠表現(xiàn)為多飲、多食、多尿，體質(zhì)量增長緩慢，活動量減少，毛色晦暗，易發(fā)生感染，注意單籠飼養(yǎng)，仔細(xì)養(yǎng)護，8周之后大鼠全部存活。

2.體質(zhì)量及血清學(xué)檢測：18只大鼠SPF環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為2組，隨后禁食12 h，測量并記錄各大鼠體質(zhì)量，使用羅氏血糖儀采取斷尾取血法測量空腹血糖；STZ注射8周后，同樣方法再次測量并記錄2組大鼠體質(zhì)量及空腹血糖值。

3.Max ICP/MAP測定：參照已報道的實驗方法[9]行頸總動脈插管，連接壓力換能器并由PowerLab/4SP 系統(tǒng)監(jiān)測平均動脈壓(mean arterial pressure， MAP)，陰莖海綿體內(nèi)插入穿刺針并連接壓力換能器，監(jiān)測大鼠海綿體壓力(intracavernous pressure, ICP)。連接PowerLab工作臺，設(shè)置電刺激參數(shù)為頻率15 Hz、脈沖1.2 ms，分別給予2.5、5 V電壓刺激海綿體神經(jīng)，每次1 min，間隔為3 min。記錄2組大鼠在2.5、5 V電壓下的ICP及MAP，結(jié)果以Max ICP/MAP表示。

4.免疫組織化學(xué)染色方法檢測2組大鼠陰莖海綿體組織中S1PR3的表達：處理陰莖組織樣品(5 μm厚度)用于免疫組化?？酒懊撓灪螅?%雙氧水中封閉內(nèi)源性過氧化物酶，漂洗后置于0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中，微波修復(fù)抗原15 min，自然冷卻后沖洗，加入山羊血清封閉切片30 min。隨后孵育一抗：滴加S1PR3抗體(1∶100)，4 ℃過夜。漂洗后滴加二抗工作液，放至37 ℃溫箱中孵育1 h。再次漂洗，滴加適量現(xiàn)配的DAB，室溫反應(yīng)10 min，蒸餾水沖洗，用蘇木素復(fù)染2～5 min，自來水沖洗。最后放置于梯度酒精中脫水，干燥后封片。顯微鏡下觀察切片并拍照。

5.PCR方法檢測S1PR3在大鼠陰莖海綿體組織中的mRNA水平：根據(jù)已報道的實驗方法[9]，提取組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄之后完成實時定量PCR檢測，測定組織中S1PR3 mRNA的表達水平。引物來源于上海生工生物工程有限公司，序列見表1。

表1 引物序列

6.Western blot測定S1PR3、RhoA、ROCK1及ROCK2在大鼠陰莖海綿體組織中的表達：切下大鼠陰莖海綿體，加入RIPA裂解物，超聲處理蛋白質(zhì)，將上清液在4 ℃預(yù)冷卻離心機中離心。BCA法檢測提取蛋白的濃度。取50 μg總蛋白，置于沸水中10 min。制備10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠以電泳蛋白，電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜在5% BSA溶液中封閉2 h，然后置于相應(yīng)的抗體中并孵育過夜。一抗選用兔抗大鼠S1PR3(1∶1 000)、RhoA(1∶500)、ROCK1(1∶1 000)、ROCK2(1∶1 000)、β-actin (1∶1 000)抗體，二抗選用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗(1∶5 000)，采用ECL化學(xué)發(fā)光并采集圖像，Quantity One軟件分析圖像結(jié)果。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、2組大鼠體質(zhì)量、血糖比較

STZ注射后，2組大鼠均飼養(yǎng)8周，均未見死亡情況。比較2組大鼠造模前后體質(zhì)量及血糖變化，結(jié)果顯示糖尿病組大鼠體質(zhì)量較正常對照組大鼠明顯減輕，血糖水平明顯高于正常對照組大鼠。見表2。

表2 2組大鼠體質(zhì)量及血糖比較

與正常對照組比較*P<0.05

二、大鼠勃起功能檢測

在15 Hz、1.2 ms條件下，予以2.5、5.0 V電刺激時，正常對照組大鼠Max ICP/MAP分別為0.78±0.13和0.81±0.11；糖尿病組大鼠則分別為0.28±0.15和0.30±0.11，糖尿病組大鼠勃起功能較正常對照組顯著降低(P<0.05)。見圖1。

A:2.5、5 V電刺激陰莖海綿體神經(jīng)，ICP和頸部MAP的壓力變化曲線;B:2種電壓刺激下的Max ICP/MAP比值統(tǒng)計圖圖1 2組大鼠勃起功能檢測(與正常對照組比較 *P<0.05)

三、免疫組織化學(xué)染色、PCR、Western blot檢測2組大鼠陰莖海綿體組織中S1PR3的表達情況

通過免疫組化染色檢測正常對照組和糖尿病組大鼠S1PR3水平。如圖2A所示，紅色剪頭指示的橙色區(qū)域為S1PR3陽性表達，與正常對照組相比，糖尿病組大鼠陰莖海綿體組織中S1PR3表達增加。通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，糖尿病組大鼠陰莖海綿體組織中S1PR3 mRNA表達明顯增加。見圖2B。Western blot結(jié)果顯示，糖尿病大鼠陰莖海綿體組織中的S1PR3蛋白表達水平明顯高于正常大鼠(P<0.05)。見圖2C。

四、Western blot測定RhoA、ROCK1、ROCK2在大鼠陰莖海綿體組織中的表達

Western blot結(jié)果顯示，糖尿病大鼠陰莖海綿體組織中的RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平明顯高于正常大鼠(P<0.05)。見圖3。

A:免疫組化檢測2組大鼠陰莖海綿體組織中S1PR3的表達(×200);B:S1PR3 mRNA在2組大鼠陰莖海綿體中的表達;C:Western blot 檢測2組大鼠S1PR3蛋白的表達圖2 正常對照組和糖尿病組大鼠陰莖海綿體S1PR3的表達(與正常對照組比較 *P<0.05)

A:Western blot 檢測2組大鼠RhoA、ROCK1、ROCK2的表達;B:RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白灰度值統(tǒng)計圖圖3 RhoA、ROCK1、ROCK2在2組大鼠陰莖海綿體中的表達(與正常對照組比較 *P<0.05)

討 論

1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phospate， S1P)是一種對機體具有重要調(diào)控作用的溶血卵磷脂類分子，分布極其廣泛，存在于各類血細(xì)胞內(nèi)和淋巴液、血液等細(xì)胞外液中，它可以在細(xì)胞中發(fā)揮信使分子的作用，也可以分泌到體液中結(jié)合各系統(tǒng)相應(yīng)受體，調(diào)節(jié)生理活動。S1PR是S1P的特異性受體，可分為S1PR1～S1PR5 5個亞型，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，可以與多種類型的G蛋白結(jié)合，激活下游相應(yīng)的信號通路，產(chǎn)生不同的生物學(xué)功能[10-11]。S1PR3在人胎盤、骨骼肌、心、腦、腎、血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞中均有表達。近年來研究發(fā)現(xiàn)，S1PR3在血管舒張及收縮、血管屏障功能及缺血再灌注損傷等過程中具有重要的生物學(xué)作用[12]。S1PR3在血管內(nèi)皮能夠通過上調(diào)PI3K/Akt信號途徑的表達，提高eNOS磷酸化水平，同時使eNOS含量升高，增加內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌NO，最終使血管擴張[13]。之后Theilmeier等[14]給予缺血/再灌注模型鼠注射S1P，也發(fā)現(xiàn)S1P/S1PR3可以通過NO依賴機制激活eNOS釋放NO，從而舒張血管。然而Salomone等[15-16]在對腦血管的研究后發(fā)現(xiàn)，S1P/S1PR3會上調(diào)RhoA/Rho激酶信號通路，使血管收縮。這些研究表明，S1PR3對血管的調(diào)節(jié)作用具有雙向性，需要進一步的研究。

在自發(fā)性高血壓誘導(dǎo)ED大鼠模型和去勢ED大鼠模型中，大鼠陰莖海綿體中的S1PR3的表達均明顯高于正常大鼠[6]。同時，RhoA、ROCK1和ROCK2的表達也顯著增加，這提示在上述2種ED大鼠模型中，陰莖海綿體組織中S1PR3的含量增加可能會促使RhoA/Rho激酶信號通路表達增高，從而增加海綿體平滑肌收縮因素，損傷大鼠勃起功能[6，17]。在本研究中，糖尿病ED大鼠陰莖海綿體組織中S1PR3的表達明顯高于正常大鼠，RhoA、ROCK1、ROCK2的表達也高于正常大鼠。根據(jù)以上結(jié)果，我們推測在Ⅰ型糖尿病大鼠體內(nèi)，陰莖海綿體組織中S1PR3 表達增加，激活下游的RhoA/Rho激酶信號通路，導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌收縮增強，最終影響勃起功能。

綜上所述，S1PR3在Ⅰ糖尿病引起的ED中起著重要作用，S1PR3表達升高可能通過RhoA/Rho激酶通路增強陰莖海綿體收縮，誘導(dǎo)ED發(fā)生。