復(fù)方甘草清瘍合劑HPLC 指紋圖譜

吳逸晨， 謝 輝， 毛春芹， 張夢(mèng)晨

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210046）

復(fù)方甘草清瘍合劑是由甘草、珍珠母、黃連、黃芩、干姜等藥味組成，根據(jù)南京市中醫(yī)院臨床有效經(jīng)驗(yàn)方研制而成的新制劑，臨床用于治療脾胃虛弱引起的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍等病癥，具有顯著療效。

中藥指紋圖譜是一種被國(guó)內(nèi)外廣泛接受的質(zhì)量評(píng)價(jià)手段，可以提供豐富的鑒別信息，反映中藥復(fù)雜化學(xué)體系的整體性質(zhì)，對(duì)中藥質(zhì)量的控制有重要意義。在構(gòu)建現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系框架的過(guò)程中，中藥指紋圖譜應(yīng)當(dāng)作為核心技術(shù)［1］。因此，為了更好地控制制劑質(zhì)量，獲得穩(wěn)定的療效，本研究采用HPLC 研究并建立了復(fù)方甘草清瘍合劑的指紋圖譜，以期為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Waters 2695 高效液相色譜儀 （美國(guó)Waters 公司）；TGL-16C 高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；CAV64C 電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。乙腈、甲醇（均為色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；磷酸（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（分析純，無(wú)錫市亞盛化工有限公司）；水為超純水。

甘草 酸 單 銨 鹽 （批 號(hào)201803）、 黃 芩 素 （批 號(hào)200571）、鹽酸小檗堿（批號(hào)200915）、鹽酸黃連堿（批號(hào)201118）、鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)200908）、表小檗堿（批號(hào)201214）、6-姜辣素（批號(hào)201838） 均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；黃芩苷（批號(hào)200514） 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；漢黃芩素（批號(hào)64320010） 購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，對(duì)照品含有量均大于98.0%。甘草、黃連、黃芩等飲片由安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司提供；珍珠母、干姜等飲片由四川新荷花中藥飲片股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備及處理

2.1.1 全方制劑 按復(fù)方甘草清瘍合劑制備工藝，制備10 批 制 劑 （S1 ～S10）， 批 號(hào) 分 別 為180701、 180702、180703、 180704、 180705、 180706、 180707、 180708、180709、180710，備用。

2.1.2 單味藥制劑 按復(fù)方甘草清瘍合劑制備工藝，分別制備方中各味藥的單味藥制劑，備用。

2.1.3 陰性制劑 按復(fù)方甘草清瘍合劑制備工藝，分別制備方中各味藥的陰性制劑，備用。

2.1.4 供試品溶液 精密量取上述制劑各1 mL，分別置10 mL量瓶中，加水定容，搖勻，高速離心（12 000 r／min，10 min），取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 對(duì)照品溶液 精密稱取甘草酸單銨鹽、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿、6-姜辣素對(duì)照品各1 mg，置于10 mL 量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，加甲醇定容，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.2 色譜條件 Waters XTerra C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～6 min，19%A；6 ～55 min，19%～26%A；55 ～80 min，26%～71%A；80 ～85 min，71%～19%A；85 ～90 min，19%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。

2.3 指紋圖譜參照峰 所建立的指紋圖譜中，15 號(hào)峰（后經(jīng)對(duì)照品對(duì)比可知為黃芩苷） 具有最大的峰面積、適中的保留時(shí)間及穩(wěn)定的峰型，因此選其為參照峰。在后續(xù)內(nèi)容中，均以該峰作為參照，以計(jì)算其余峰的相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.1.5” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各峰峰面積及保留時(shí)間的RSD 分別為2.154%～2.331%、0.009%～0.215%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取 “2.1.1” 項(xiàng)下全方制劑， 按“2.1.4” 項(xiàng)下方法，平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰峰面積及保留時(shí)間的RSD 分別為1.104%～2.153%、0.052%～0.892%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.4” 項(xiàng)下供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰峰面積及保留時(shí)間的RSD 分別為1.280%～1.969%、0.033%～1.069%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 共有模式及相似度 取10 批復(fù)方甘草清瘍合劑，按“2.1.4” 項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，將所得色譜圖以cdf 格式保存，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723 版本），以平均數(shù)法生成復(fù)方甘草清瘍合劑的指紋圖譜共有模式，見(jiàn)圖1～2。

圖1 10 批合劑HPLC 指紋圖譜

取10 批復(fù)方甘草清瘍合劑，按“2.1.4” 項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，將所得色譜圖以cdf 格式保存，與共有模式一同導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723 版本），參照15 號(hào)峰，計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積；以共有模式作為參照?qǐng)D譜，設(shè)其相似度1.000，計(jì)算10 批煎液的相似度，結(jié)果見(jiàn)表1～3。

圖2 復(fù)方甘草清瘍合劑指紋圖譜共有模式

表1 10 批合劑共有峰相對(duì)保留時(shí)間

根據(jù)上述結(jié)果可知，10 批復(fù)方甘草清瘍合劑指紋圖譜的相似度均大于0.95，圖譜中各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積差異亦較小，表明該方法穩(wěn)定、可行，得到的復(fù)方甘草清瘍合劑指紋圖譜相似度良好。

2.5.2 共有峰歸屬 取“2.1.4” 項(xiàng)下各供試品溶液及“2.1.5” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣，將所得色譜圖進(jìn)行對(duì)比，見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液中各成分在全方合劑圖譜中均能出峰。除漢黃芩素及6-姜辣素外，各陰性制劑圖譜提示上述其他成分均無(wú)干擾，表明這些峰具有較好的專屬性，可作為復(fù)方甘草清瘍合劑指紋圖譜中被確認(rèn)化學(xué)本質(zhì)的特征峰。

表2 10 批合劑共有峰相對(duì)峰面積

表3 10 批合劑相似度

復(fù)方甘草清瘍合劑指紋圖譜中共可確定30 個(gè)共有峰，標(biāo)號(hào)為1～30。組成全方的藥味中，黃芩對(duì)全方指紋圖譜的貢獻(xiàn)度最大，其次為黃連、甘草、干姜。30 個(gè)共有峰中，2、6、7、26、27、30 號(hào)等6 個(gè)峰來(lái)自甘草，但其中7 號(hào)峰有一定干擾；7、8、9、15、18、19、20、21、22、23、28、29 號(hào)等12 個(gè)峰來(lái)自黃芩，但7、8 號(hào)峰有一定干擾；1、3、4、7、8、10、11、12、13、14 號(hào)等9 個(gè)峰來(lái)自黃連，但7、8 號(hào)峰有一定干擾；28 號(hào)峰來(lái)自干姜，但有一定干擾。上述共有峰中，7 號(hào)峰由黃連、黃芩2 味藥疊加而成，8 號(hào)峰由甘草、黃芩、黃連3 味藥疊加而成；28 號(hào)峰由黃芩、干姜2 味藥（漢黃芩素、6-姜辣素）疊加而成，但在黃芩陰性制劑圖譜中未見(jiàn)28 號(hào)峰，干姜單味藥制劑圖譜中28 號(hào)峰也極小，推測(cè)是由于干姜在處方中劑量較小，且其主要有效成分易揮發(fā)，在合劑制備過(guò)程中轉(zhuǎn)移率低而導(dǎo)致。除7、8、28 號(hào)峰外，其余特征峰無(wú)干擾，有較好的專屬性。

在共有峰的歸屬過(guò)程中，5、16、17、24、25 號(hào)峰未能歸屬到任何一味藥中，可能是方中諸藥在合煎過(guò)程中相互作用生成了新成分。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了復(fù)方甘草清瘍合劑HPLC 指紋圖譜，從中指認(rèn)了30 個(gè)共有峰，并通過(guò)對(duì)照品確認(rèn)了其中9 個(gè)峰的化學(xué)本質(zhì)，分別為甘草酸、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、6-姜辣素。同時(shí)，測(cè)定了10 批復(fù)方甘草清瘍合劑的指紋圖譜，其相對(duì)保留時(shí)間及峰面積值較為穩(wěn)定，相似度高，表明該方法可作為復(fù)方甘草清瘍合劑質(zhì)量控制的依據(jù)。

復(fù)方甘草清瘍合劑中的主要藥味甘草、黃連、黃芩等均為常用中藥，其在復(fù)方制劑中的指紋圖譜研究也多見(jiàn)報(bào)道［2-8］。課題組在分析相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，供試品處理方法多較為繁瑣，且部分共有峰分離度不能達(dá)到滿意的效果。本研究曾比較了水稀釋液與醇沉上清液的圖譜，未見(jiàn)明顯差異，故最終選擇了藥液用水稀釋后直接進(jìn)樣的方法，操作簡(jiǎn)單、節(jié)省資源，且共有峰的分離度理想，為這些中藥的指紋圖譜研究提供了新思路。

圖3 各成分HPLC 色譜圖

本研究采用不同濃度的磷酸水溶液、三乙胺水溶液作為水相，結(jié)果表明0.1%磷酸水溶液有較好的洗脫能力和分離能力，尤其是對(duì)于制劑中黃芩、黃連主要成分有良好的分離效果，故最終選擇其為水相。同時(shí)比較了乙腈和甲醇2 種有機(jī)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇不能較好地對(duì)樣品進(jìn)行洗脫和分離，故選擇乙腈為流動(dòng)相。此外，還比較了不同柱溫、不同色譜柱對(duì)特征峰分離度的影響，最終確定使用Waters XTerra C18色譜柱，柱溫25 ℃。

本研究建立的復(fù)方甘草清瘍合劑指紋圖譜中有部分藥味沒(méi)有指認(rèn)到共有峰，可能是由于這些藥（如珍珠母） 中的主要成分［9］不適宜使用該色譜條件進(jìn)行測(cè)定，故該色譜條件下無(wú)法對(duì)這些藥進(jìn)行質(zhì)量控制，后續(xù)應(yīng)嘗試采用其他方法控制其在本方中的質(zhì)量。

在進(jìn)行共有峰歸屬的過(guò)程中，推測(cè)5、16、17、24、25號(hào)峰可能是諸藥合煎生成的新成分，這些新成分的出現(xiàn)可能使中藥復(fù)方比單味中藥具有更多的藥理作用或更強(qiáng)的療效，體現(xiàn)了中藥配伍運(yùn)用的合理性，這也與多數(shù)學(xué)者的研究觀點(diǎn)相符合［10］。

在分析復(fù)方甘草清瘍合劑的指紋圖譜時(shí)，發(fā)現(xiàn)與單味藥制劑相比，全方制劑中來(lái)自黃芩、黃連的共有峰峰面積有顯著下降。通過(guò)文獻(xiàn)分析可知［11-15］，黃芩、黃連在共煎時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量絡(luò)合物沉淀，從而使來(lái)自黃芩、黃連的成分在水煎液中含有量大幅度降低。另有文獻(xiàn)表明，黃芩黃連共煎沉淀物的生物利用度極低16-17］，故后續(xù)可進(jìn)一步研究黃芩、黃連共煎是否會(huì)降低療效及如何提高其生物利用度等。

此外，通過(guò)分析各批次指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，發(fā)現(xiàn)各批次間所有共有峰的相對(duì)保留時(shí)間差異都極小，但某些共有峰在各批次間的相對(duì)峰面積有較顯著的差異，這可能是不同批次的制劑所使用的原料飲片存在一定的質(zhì)量差異，從而造成了這一結(jié)果。因此，后續(xù)研究可從不同產(chǎn)地飲片的質(zhì)量入手，選擇優(yōu)質(zhì)原料藥，嚴(yán)格控制制劑的質(zhì)量，以期獲得較佳的臨床療效。