高分子微針導(dǎo)入聯(lián)合卡泊三醇軟膏治療小鼠銀屑病的實(shí)驗(yàn)研究

梁 玲 ，陳博智 ，沈長(zhǎng)兵 ，崔 勇 ?，郭新東 ?

（1.北京化工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 皮膚病與性病科，北京 100029；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 研究生院，北京 100730）

銀屑病是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病。咪喹莫特是一種小分子免疫調(diào)節(jié)劑，可以誘導(dǎo)誘導(dǎo)用藥部位產(chǎn)生炎癥因子，出現(xiàn)類似銀屑病的癥狀[1]。高分子微針預(yù)處理皮膚，可以形成微孔道，增加了藥物的經(jīng)皮滲透率，對(duì)銀屑病的治療起到很好地促進(jìn)作用。但是缺少實(shí)驗(yàn)依據(jù)，無臨床上的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)小鼠造模成功后用高分子微針處理，觀察聯(lián)合卡泊三醇對(duì)銀屑病的治療效果，為高分子微針導(dǎo)入藥物治療皮膚病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物為4～6周雌性Balb/c小鼠30只，體重16g左右，由維通利華提供，合格證號(hào)為京ICP備15004894號(hào)-1。在SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)用標(biāo)準(zhǔn)飼料和小鼠專用水飼養(yǎng)，攝食飲水自由。

實(shí)驗(yàn)藥品：5%咪喹莫特乳膏（3g：0.15g，四川明欣藥業(yè)有限公司產(chǎn)，批號(hào)18060340），卡泊三醇軟膏（15g：0.75mg，愛爾蘭利奧制藥有限公司產(chǎn)，批號(hào) A70529），聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184，美國道康寧公司，批號(hào) H04714G076），聚乳酸（PLA，Lakeshore生物材料有限公司）。

儀器：超聲波清洗器（北京博翔興旺科技有限公司，型號(hào)：BXXW-30AL）、激光刻蝕機(jī)（美國U-niversal，型號(hào)：VLS 3.5，50W）、小動(dòng)物專用吸入麻醉機(jī)（美國Matrx集團(tuán)，型號(hào)：VMR），數(shù)字波片儀（德國萊卡，型號(hào)：DM6 B）。

1.2 方法

1.2.1 高分子微針的制備

首先，制備聚二甲基硅氧烷（PDMS）板。將PDMS的預(yù)聚物和固化劑按質(zhì)量比10：1混合，充分?jǐn)嚢?。在真空干燥箱?nèi)放置去除其中的氣泡。將未固化PDMS倒入夾板中，在恒溫恒濕箱60℃固化5h，得到PDMS板。然后，在PDMS板上平鋪厚度為0.3mm的硅膠板，通過控制激光雕刻機(jī)激光的能量和速度打出所需高度的PMDS模板[2，3]。此實(shí)驗(yàn)中高分子微針規(guī)格為高度300μm，間距1000μm，底部直徑 150μm（圖1）。

1.2.2 動(dòng)物分組

圖1 高分子微針的光學(xué)顯微圖

將Balb/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，在30只小鼠內(nèi)任取10只，作為組1（空白對(duì)照組），剩下的20只隨機(jī)分為4組，分別為組2（造模組）5只、組3（咪喹莫特組）5只、組4（卡泊三醇治療組）5只及組5（高分子微針處理組）5只。

1.2.3 造模方法

5%濃度的咪喹莫特乳膏均勻涂抹于小鼠兩耳內(nèi)外側(cè)，給藥量為 20mg/cm2，1次/d，連續(xù)涂抹6d，建立銀屑病模型。

1.2.4 給藥及處理方法

空白對(duì)照組不給予任何處理，其余組造模。造模d7，空白對(duì)照組隨機(jī)處死5只，造模組全部處死，取耳部用組織固定液固定，做組織病理學(xué)研究。造模成功后，咪喹莫特組不做任何處理；卡泊三醇治療組在兩耳內(nèi)外側(cè)均勻涂抹卡泊三醇軟膏，1次/d，每次30mg/cm2；高分子微針處理組先用高分子微針預(yù)處理，打開一條微孔道，再用卡泊三醇軟膏治療，治療方法同卡泊三醇治療組。治療5d后，空白對(duì)照組剩余的5只小鼠與咪喹莫特組、卡泊三醇治療組、高分子微針處理組小鼠一起處死，取耳部做組織病理學(xué)研究。

1.3 觀察指標(biāo)

肉眼觀察小鼠耳部鱗屑、紅斑、浸潤(rùn)、皮損情況，以評(píng)價(jià)造模效果及治療療效。光鏡下觀察耳部皮損病理變化，利用軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，參照Baker法進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分[4]，并對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)數(shù)[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察耳部形態(tài)結(jié)果

咪喹莫特處理的d2，小鼠耳部由白色變成粉紅色，d4出現(xiàn)細(xì)小的白色鱗屑，血管擴(kuò)張明顯，嚴(yán)重部位有紅斑出現(xiàn)。d7，角質(zhì)層增厚明顯，出現(xiàn)大片鱗屑，血管擴(kuò)張明顯。停用咪喹莫特乳膏后，有明顯的好轉(zhuǎn)，且用高分子微針處理優(yōu)于只用卡泊三醇治療（圖2見封二）。

圖2 各組小鼠雙耳的形態(tài)比較

圖3 小鼠耳部皮膚病理改變（HE×100）

2.2 光鏡下觀察結(jié)果

空白對(duì)照組光鏡下觀察可見皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮層未見角化過度及角化不全、棘層增厚、顆粒層變薄或消失的情況，角質(zhì)層很薄，真皮層未見毛細(xì)血管擴(kuò)張或水腫，只有稀疏散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。造模組表皮層廣泛存在角化過度、顆粒層變薄、棘層明顯增厚，其中多處可見Munro微囊腫，真皮層毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、水腫，血管周圍有輕到中度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

表1 Balb/c小鼠耳部銀屑病組織學(xué)評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分

表1示，空白對(duì)照組和造模組的組織學(xué)評(píng)分和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分，均存在顯著性差異（均P＜0.01），表明造模成功。停用咪喹莫特乳膏，組3、組4、組5小鼠耳部皮膚有所改善，皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮層的角化過度程度減輕，顆粒層變薄程度減輕，棘層增厚程度減輕，真皮層毛細(xì)血管擴(kuò)張程度減輕。組5減輕程度較組3、組4高，表明高分子微針預(yù)處理對(duì)銀屑病的治療有效（圖3見封二）。組4（卡泊三醇治療組）與組5（高分子微針治療組）比較，組5皮損減輕程度顯著大于組4（P＜0.01），表明高分子微針預(yù)處理能促進(jìn)藥物吸收利用，更好地改善銀屑病癥狀。

3 討論

銀屑病是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，其主要特征是角化過度或角化不全，角質(zhì)層內(nèi)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞構(gòu)成的Munro微囊腫，顆粒層變薄或消失，棘層增厚，血管扭曲擴(kuò)張，管壁輕度增厚，真皮上部輕到中度炎細(xì)胞浸潤(rùn)[6，7]。銀屑病病因復(fù)雜，目前主要認(rèn)為與環(huán)境、遺傳、感染、內(nèi)分泌、免疫等因素有關(guān)，是多基因遺傳背景下T細(xì)胞異常的炎癥性疾病[8]。造模7d時(shí)，可看到小鼠耳部有大量鱗屑出現(xiàn)，局部有紅斑，毛細(xì)血管擴(kuò)張，符合銀屑病的相關(guān)癥狀。

銀屑病幾乎不在動(dòng)物身上出現(xiàn)，所以很難找到理想的動(dòng)物模型[9]。咪喹莫特是一個(gè)小分子的免疫調(diào)節(jié)劑，能誘導(dǎo)用藥局部產(chǎn)生多種炎癥因子，出現(xiàn)類似銀屑病的癥狀。本實(shí)驗(yàn)中用咪喹莫特造模[1]，刺激小鼠耳部出現(xiàn)銀屑病癥狀。研究結(jié)果顯示，造模組組織學(xué)評(píng)分與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分與空白對(duì)照組對(duì)比均明顯升高（P＜0.01），表明小鼠銀屑病模型造模成功。

20世紀(jì)90年代以來，隨著微機(jī)電加工技術(shù)的發(fā)展及經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的逐漸完善，一種新的給藥途徑——微針經(jīng)皮給藥的出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)注射針法和膏藥治療的缺陷被彌補(bǔ)[10]。目前，應(yīng)用于皮膚表面預(yù)處理增強(qiáng)藥物滲透率的微針根據(jù)材質(zhì)不同分為硅微針、金屬微針和高分子微針。Park等人[11]采用生物可降解的高分子通過基于模具的制造方法來制備高分子實(shí)心微針。與硅微針和金屬微針相比，高分子微針具有很多優(yōu)勢(shì)。首先，由于高分子聚合物具有粘彈性的性質(zhì)，改善了高分子實(shí)心微針耐剪切誘導(dǎo)斷裂的機(jī)械優(yōu)點(diǎn)。其次，高分子實(shí)心微針通常在可以重復(fù)使用的模具中制備，因此高分子實(shí)心微針具有造價(jià)低，易于批量化制備的優(yōu)點(diǎn)。此外，高分子微針有很好的生物相容性和可降解性，對(duì)皮膚傷害極小。最重要的是，微針在進(jìn)行給藥時(shí)，通過刺穿皮膚的最外層即角質(zhì)層為藥物的遞送打開了一條由角質(zhì)層到表皮層或真皮淺層的微通道，使得藥物活性分子到達(dá)表皮層或真皮淺層時(shí)，能夠更好地被吸收，從而增加藥物經(jīng)皮滲透率。本研究通過卡泊三醇治療組、高分子微針處理組與咪喹莫特組對(duì)比，其評(píng)分明顯降低（P＜0.01），表明卡泊三醇對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病有很好的治療作用，能夠抑制銀屑病皮損的增生和分化。高分子微針處理組評(píng)分明顯低于卡泊三醇治療組（P＜0.01），說明微針的預(yù)處理能夠打開一條微孔道，使藥物更容易進(jìn)入皮膚，增加了藥物的吸收利用率，增加銀屑病的治療療效。

本研究證實(shí)，咪喹莫特造模操作簡(jiǎn)單，組織病理學(xué)上符合銀屑病病理特征，是研究銀屑病的一種理想模型。高分子微針預(yù)處理，能很好地改善銀屑病模型的病理變化，為微針的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，將來有望應(yīng)用于臨床，解決銀屑病患者給藥吸收率低、效果差的問題。