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    南極衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L硝酸還原酶基因的生物信息學(xué)分析

    2012-10-08 12:49:42林敏卓劉晨臨黃曉航楊平平
    海洋科學(xué)進(jìn)展 2012年4期
    關(guān)鍵詞:衣藻綠藻還原酶

    林敏卓,劉晨臨,黃曉航,楊平平

    (1.山東輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353;2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所,山東 青島 266061;3.國(guó)家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266061)

    硝酸鹽是許多海區(qū)浮游植物中氮的主要來源,經(jīng)浮游植物吸收后,在體內(nèi)經(jīng)過一系列酶的還原作用,最終轉(zhuǎn)化成為氨氮后合成其他有機(jī)物質(zhì)[1-2]。存在于細(xì)胞質(zhì)的硝酸還原酶(NR)是氮素同化作用中的限速酶[3],可直接調(diào)節(jié)硝酸鹽還原,從而調(diào)節(jié)氮代謝,處于植物氮代謝的關(guān)鍵位置,其活力的大小直接影響了硝酸鹽的生物利用度,在海洋生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程中占有極其重要的地位。

    高等植物的NR是由相同亞基組成的二聚體,每個(gè)單體含有1條100kDa的多肽和3個(gè)輔助因子,即FAD,細(xì)胞色素和鉬輔因子(MoCo)。每個(gè)輔助因子相當(dāng)于1個(gè)氧化還原中心。NR分子中電子的傳遞途徑為:NAD(P)H+H+→FAD→細(xì)胞色素→MoCo→硝酸鹽[4]。

    2000年Yamasaki等[5]首次證實(shí),在pH7.0的離體條件下,玉米誘導(dǎo)型硝酸還原酶(inducible NR,iNR)具有以NADH作為電子供體,催化亞硝酸鹽的單電子還原合成一氧化氮(NO)的能力;Zhao等人[6]對(duì)擬南芥的NR野生型和缺陷性突變株研究表明,通過NR蛋白的積累,依賴于NR的NO合成對(duì)擬南芥的冷適應(yīng)有很重要的作用。

    目前,有關(guān)NR的研究主要集中在近海有關(guān)的浮游植物方面,對(duì)極地多樣化的浮游植物群落的相關(guān)研究開展的還很少。南極地區(qū)具有獨(dú)特的地理及氣候特征,嚴(yán)酷的極地環(huán)境造就了生活在海冰環(huán)境中的真核光合微藻(冰藻)獨(dú)特的生物學(xué)特性。在南極海冰的形成、生長(zhǎng)和融化的季節(jié)性變化中,冰藻也經(jīng)受了溫度、光照等生態(tài)條件的劇烈變化。為數(shù)不多的研究報(bào)道表明,南極冰藻NR的結(jié)構(gòu)和酶活特征與常溫浮游植物的存在明顯差異:Rigano等[7]比較了溫度對(duì)南極嗜冷單細(xì)胞藻(KoliellaAntarctica)和常溫藻(Chlorellasorokiniana)的NR酶活的影響,發(fā)現(xiàn)嗜冷藻最適酶活溫度為15℃,在10℃時(shí)仍能保持77%的活性。

    南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)是分離自南極海冰中的一種單細(xì)胞綠藻,對(duì)低溫、高鹽等逆境具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。衣藻生活的海冰鹽囊的鹽濃度可達(dá)海水鹽濃度的5倍,同時(shí)承受著低至-25℃的低溫脅迫[8]。通過室內(nèi)培養(yǎng)南極冰藻研究發(fā)現(xiàn),其最適生長(zhǎng)溫度在4~10℃左右,最高生長(zhǎng)溫度不超過15℃,培養(yǎng)液置于-20℃冰箱保存,不影響其活力,在5倍正常海水鹽度的條件下(150‰),仍然能夠正常生長(zhǎng),目前還沒有冰藻最低生長(zhǎng)溫度的報(bào)道。

    本研究通過對(duì)克隆到南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)NR基因的序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析,旨在通過與其它藻類進(jìn)行比較分析,為南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)的抗凍機(jī)制和NR基因功能的研究提供參考和依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)由中國(guó)極地研究所(上海)提供,在南極中山站(69°S,77°E)附近浮冰中分離得到。藻種接種于滅菌海水配置的Provasoli培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為7℃,1 300~1 600lx和12L/12D。

    南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)的NR基因序列來自于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)cDNA文庫,測(cè)序由上海桑尼生物技術(shù)有限公司代為執(zhí)行。

    1.2 NR基因的生物信息學(xué)分析

    NR基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF)分析通過 NCBI網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行操作,用DNAStar軟件包中的EditSeq軟件預(yù)測(cè)蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)。通過SWISS-MODEL[9-11](http:∥swissmodel.expasy.org/)網(wǎng)站預(yù)測(cè) NR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

    將測(cè)定的NR序列用BLAST軟件與GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知的其他NR序列進(jìn)行比對(duì)。選取相似性較高的序列[12]用BioEdit軟件進(jìn)行對(duì)位排列,人工校正和合并序列。用MEGA 4.0[13]軟件分析中的緊鄰法(neighbor-joining method,NJ),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,通過自展檢測(cè)法(bootstrap test)估計(jì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性,重復(fù)次數(shù)為1 000次。運(yùn)用MegAlign軟件將ICE-L的NR基因和其它4個(gè)遺傳距離較近的綠藻NR基因進(jìn)行氨基酸序列同源性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NR基因的序列分析

    測(cè)序分析表明,該基因全長(zhǎng)為3 053bp,含有1個(gè)完整的開放閱讀框,編碼863個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白的理論分子量為96.11kDa,等電點(diǎn)為6.42。

    將預(yù)測(cè)的NR氨基酸序列進(jìn)行Protein Blast分析發(fā)現(xiàn)其含有與鉬輔因子、細(xì)胞色素b5和FAD功能域相似的序列(圖1)。

    圖1 Blast分析NR基因可能含有的功能域Fig.1 The functional domains of NR gene predicted by Blast analysis

    2.2 NR的系統(tǒng)發(fā)育分析

    通過對(duì)南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)NR氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)可以看出南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)的NR基因與綠藻中的團(tuán)藻、萊茵衣藻,杜氏鹽藻和小球藻等綠藻的親緣關(guān)系最近,其次是硅藻中的三角褐指藻和海鏈藻,以及紅藻中的江蘺。

    圖2 NR的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of NR genes

    2.3 NR的氨基酸序列同源性分析

    運(yùn)用MegAlign軟件將南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)的NR氨基酸序列和4種綠藻的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)并研究了其活性位點(diǎn)(圖3,其中,黑體字表示各亞基的起始位點(diǎn);普通字體加下劃線表示不同NR中起關(guān)鍵作用的保守氨基酸序列;黑體加下劃線表示不同NR中起關(guān)鍵作用的氨基酸序列中氨基酸殘基的差異),從分析結(jié)果可看出南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)與其他4種綠藻的各功能域的氨基酸序列之間還是有一些明顯的差異,南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)與團(tuán)藻、萊茵衣藻,杜氏鹽藻和小球藻的同源性依次分別為63%,61%,60%和54%。

    圖3 南極衣藻(Chlamydomonas sp.ICE-L)NR和4種不同NR氨基酸序列同源性分析Fig.3 Homological analysis of amino acid sequence carried out for ICE-L NR and other 4types of NRs

    2.4 NR基因的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

    將南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)的NR氨基酸序列提交到SWISS-MODEL預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)其存在3段不同的功能域序列(表1),其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖4所示,其中,A,B,C分別為不同肽段所對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)模型。

    由表1可見,所預(yù)測(cè)的南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)的NR氨基酸序列含有的3段不同的功能域,與上述Blast分析的結(jié)果相一致。

    表1 預(yù)測(cè)南極衣藻(Chlamydomonas sp.ICE-L)硝酸還原酶所含3個(gè)肽段的信息Table 1 Information about the predicted three peptides of the ICE-L nitrate reductase

    圖4 預(yù)測(cè)南極衣藻(Chlamydomonas sp.ICE-L)硝酸還原酶所含三個(gè)肽段的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The predicted 3Dstructures of the ICE-?L nitrate reductase

    3 討 論

    對(duì)不同物種的研究發(fā)現(xiàn),不同生物的硝酸還原酶的亞基組成和分子量變化很大[14]:小球藻(Chlorella vulgaris)的硝酸還原酶由4個(gè)分子質(zhì)量為90kDa的亞基組成,布朗纖維藻(Ankistrodesmusbraunii)則是由8個(gè)分子質(zhì)量為60kDa的亞基組成,鏈孢囊(Neurosporacrassa)和黏紅酵母(Rhodotorulaglutinis)均含有2個(gè)分子質(zhì)量分別是115kDa和118kDa的亞基,膝溝藻(Gonyaulax)的硝酸還原酶由6個(gè)分子質(zhì)量為52kDa的亞基組成。海洋硅藻中的硝酸還原酶在分子質(zhì)量上與高等植物相近,大約為95~120kDa。但是甲藻中硝酸還原酶的組成基團(tuán)的分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于該值,只有52kDa。通過核酸序列推斷南極冰藻的硝酸還原酶單一亞基的分子量為96kDa,與已報(bào)道的綠藻該酶的分子量相近。

    多個(gè)物種的NR氨基酸序列比對(duì)分析表明,南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)NR和幾種綠藻NR的同源性比較高(平均為59.5%)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示,南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)NR與綠藻NR的進(jìn)化距離較近,與高等植物和真核菌NR的距離較遠(yuǎn)。蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)分析顯示,南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)NR含有與高等植物NR相類似的3個(gè)不同的功能結(jié)構(gòu)域,分別為:FAD,細(xì)胞色素和鉬輔因子。從這一結(jié)果來看,南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)NR與綠藻的NR相類似。

    已有的一些研究表明,藻類的硝酸還原酶特性會(huì)因藻種的不同而存在差異,進(jìn)而導(dǎo)致了藻類對(duì)硝酸鹽利用效率的差異。南極冰藻NR具有有別于常溫藻活性特征。Gao等[16]發(fā)現(xiàn)南極海鏈藻(Thalassiosiraantarctica)和南極棕囊藻(PhaeocystisantarcticaVona)的NR酶活的最適溫度相比較于常溫藻的更低。Vona[15]和 Rigano等[7]通過對(duì)南極冰藻(Koliellaantarctica)和小球藻(Chlorellasorokiniana)的硝酸還原酶活性的比較研究發(fā)現(xiàn),不同來源藻類的NR適應(yīng)的溫度范圍不同,冰藻K.antarctica的NR具有比C.sorokiniana的NR有更好的冷適應(yīng)性和低溫下更高的酶活特性。

    南極衣藻對(duì)逆境所表現(xiàn)的強(qiáng)大的耐受力使其成為植物抗逆機(jī)制研究的理想材料,從南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)中克隆到的NR序列,是目前唯一一條有報(bào)道的南極冰藻NR基因序列。通過對(duì)南極衣藻南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)與其他物種的生物信息學(xué)的比較研究分析:一方面,可以為南極衣藻(Chlamydomonassp.ICE-L)中NR的功能和酶學(xué)的深入研究提供參考;另一方面,為南極衣藻在抗凍機(jī)制上的研究提供參考。

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