柳珊瑚Leptogorgia rigida中甾體類成分研究

肖細(xì)姬, 鄧蕓, 謝路鳳, 張琪, 韋霞, 于鑫, 張翠仙

柳珊瑚中甾體類成分研究

肖細(xì)姬, 鄧蕓, 謝路鳳, 張琪, 韋霞, 于鑫, 張翠仙

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006

首次對南海柳珊瑚中甾體類次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。采用硅膠柱柱層析、十八烷基硅烷鍵合硅膠填料、Sephadex LH-20、高效液相色譜(HPLC)及薄層色譜(TLC)等多種方法進(jìn)行分離純化, 通過核磁共振波譜(NMR)、質(zhì)譜(MS)等現(xiàn)代波譜分析及物理常數(shù)對照等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。從南海柳珊瑚次生代謝產(chǎn)物中分離得到8個甾類化合物, 結(jié)構(gòu)依次為: 3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7-en-9-one (1); 3, 6, 11- trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7-en-9-one (2); 3, 6, 11-trihydroxy-5-chloest-7, 22()-dien-9-one (3); pregnan-4-en-3, 20-dione (4); 5-pregnan-3, 20-dione (5); 3-hydroxy-pregnan-5-en-20-dion (6); 3-hydroxy-5-pregnan-20-one (7); 和3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-gorgosterol (8)。所有化合物均首次從屬中得到。

南海柳珊瑚; 甾類化合物; 斷甾醇; 結(jié)構(gòu)鑒定

海洋生物由于其高壓、高鹽、低溫、寡營養(yǎng)、無光照等特殊的海洋生境, 使得其次生代謝產(chǎn)物與陸生生物相比在化學(xué)結(jié)構(gòu)類型上更豐富, 其藥理活性更多樣, 因此引發(fā)化學(xué)、醫(yī)藥類學(xué)者的廣泛關(guān)注(Blunt et al, 2014-2018)。目前報(bào)道的柳珊瑚化學(xué)成分主要有三大類: 萜類、甾醇和生物堿, 且以二萜為主(柴興云等, 2012; 高程海等, 2013; Blunt et al, 2014-2018)。SciFinder檢索發(fā)現(xiàn), 目前對屬柳珊瑚次生代謝產(chǎn)物的研究較少, 僅有(Ksebati et al, 1984)、(Cimino et al, 1984; Garrido et al, 2000; Boonananwong et al, 2008)、(Kingsley et al, 2001)(Gutiérrez et al, 2005)(Gutiérrez et al, 2005)(Keyzers et al, 2006)(Ortega et al, 2008)、(Moritz et al, 2014)和(Mirallès et al, 1995)等柳珊瑚的相關(guān)報(bào)道, 其化學(xué)成分主要涉及西松烷二萜類和甾體兩大類。

本文首次對產(chǎn)自我國南海海域的屬柳珊瑚的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究, 共分離得到8個甾體類化合物, 經(jīng)過現(xiàn)代波譜分析(核磁、MS等)及物理常數(shù)對照等方法確定其結(jié)構(gòu)依次為: 3, 6, 11- trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7-en-9-one (1); 3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7-en-9-one (2); 3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-chloest-7, 22 ()-dien- 9- one (3); pregnan-4-en-3, 20-dione (4); 5- pregnan-3, 20-dione (5); 3-hydroxy-pregnan-5-en- 20-dione (6); 3-hydroxy-5-pregnan-20-one (7); 柳珊瑚甾醇 (8)。所有化合物均首次從屬柳珊瑚中得到。

圖 1 來源于柳珊瑚Leptogorgia rigida的斷甾醇(1~3)和孕甾醇(4~7)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器: 超導(dǎo)核磁共振儀AVANCE AV 400 MHz(瑞士Bruker 公司)、Bruker AVANCE IIIT 600 MHz(瑞士Bruker BioSpin 公司); 質(zhì)譜儀VG ZABHS(ESI, 美國Finnigan 公司)、質(zhì)譜儀DSQ(EI, 美國Thermo 公司); 超聲波清洗機(jī)KQ-500DB(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); 分析電子天平ER-120A (日本A&D公司); 恒溫水油浴鍋RE-2010(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); 高效液相色譜儀QuikSep(北京慧德易科技有限責(zé)任公司); MCP200 數(shù)字式旋光儀(上海桑戈生物科技有限責(zé)任公司)。

試劑及材料: 石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙醇、正丁醇(分析純AR, 天津市致遠(yuǎn)精細(xì)化工有限公司); ODS(60mm、日本YMC公司)、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(60mm、日本YMC公司); 柱層析硅膠(200~300目)和硅膠GF254(均為青島海洋化工廠分廠)、HPLC半制備色譜柱Kromasil 100-5-C18 5mm, 10×250mm(瑞士Kromasil公司)。

1.2 樣品來源

柳珊瑚SYDLD-7于2004年采自中國南海三亞附近海域, 經(jīng)中國科學(xué)院南海海洋研究所李秀保博士對其進(jìn)行種屬鑒定, 確定其為; 樣品標(biāo)本(編號: SYDLD-7)保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院海洋天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室。

1.3 提取分離

將柳珊瑚(2.6kg, 干重)用工業(yè)酒精在室溫下浸泡提取(10 L × 4次/7天), 將浸提液減壓濃縮得到粗浸膏。用水將該浸膏捏溶, 并且依次用等體積的乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)先后萃取, 分別萃取至萃取液無色, 得到乙酸乙酯部位浸膏48.5g和正丁醇部位浸膏150g。

取乙酸乙酯部位(48.5g)浸膏經(jīng)正相硅膠(200~ 300目，500g; 柱子直徑=12cm, 柱長=60cm)柱粗分, 以石油醚-乙酸乙酯體系(100%、15%、25%、35%、50%、65%、80%、0%)梯度依次洗脫, 經(jīng)過TLC薄層追蹤合并得到10個極性不同的組分(標(biāo)號為Fr1—Fr10)。Fr4(4.5g)硅膠柱色譜(200~300目, 80g; 柱子=3.0cm,=60cm), 石油醚-乙酸乙酯體系洗脫(85%、80%、75%、70%), TLC追蹤合并, 得Fr4-1—Fr4-9。Fr4-4(108 mg)乙酸乙酯重結(jié)晶得化合物8(40mg)。Fr4-6(45mg)經(jīng)Pre-HPLC純化(Kromasil色譜柱, 5mm, 10×250mm), 甲醇水體系(V甲醇︰V水=8︰2)等度洗脫, 依次得化合物4 (4mg, 保留時間R=12.5min)、6 (3mg,R=14.3min)和7 (8mg,R= 15.5min)。Fr4-8(506mg)經(jīng)開放Sephdex LH-20 (40~ 60mm, 100g; 層析柱=2cm,=1.8m)柱層析, 氯仿甲醇(V氯仿︰V甲醇=1︰1)等度洗脫, 得3個流份Fr4-8-1—Fr4-8-3。Fr4-8-2(50mg)經(jīng)Pre-HPLC純化(Kromasil色譜柱, 5mm, 10×250mm), 甲醇水體系(V甲醇︰V水=65︰35)等度洗脫, 依次得化合物7 (5.5mg,R= 12.5min)。Fr9(0.86mg)經(jīng)開放的ODS柱層析(60mm, 100g; 層析柱=2.5cm,=65cm)等度甲醇水體系(V甲醇︰V水=7:3)洗脫得Fr9-1和Fr9-2。Fr9-2(38mg)經(jīng)Pre-HPLC純化(Kromasil色譜柱, 5mm, 10×250mm), 甲醇水體系(V甲醇︰V水=6:4)等度洗脫, 依次得化合物1(8.0mg,R=13.5min)、2(2.0mg,R=13.0min)、3(2.0mg,R=14.5min)。

1.4 物理常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)

化合物1: 白色固體, UV 254nm下有暗斑。[α]D26?10.00° (0.04, MeOH), ESI-MS435 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, CD3OD):dHppm 6.61 (s, 1H), 4.23 (d, 1H, 4.0 Hz), 3.76 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.29 (m, 1H), 1.91 (s, 2H), 1.17 (s, 3H), 1.04 (d, 3H, 4.0 Hz), 0.92 (d, 3H, 4.0 Hz), 0.90 (d, 3H, 4.0 Hz), 0.74 (s, 3H);13C NMR (150 MHz, CD3OD):dCppm 206.2 (s), 149.3 (s), 137.4 (d), 70.8 (d), 69.7 (d), 59.2 (t), 51.6 (d), 49.9 (d), 49.8 (d), 47.2 (t), 46.1 (t), 43.6 (d), 42.2 (t), 40.6 (t), 36.5 (t), 36.0 (d), 33.7 (t), 33.2 (t), 31.3 (t), 29.1 (d), 28.0 (t), 27.1 (t), 25.6 (t), 23.1 (s), 22.9 (s), 19.4 (s), 17.6 (s), 16.5 (s)。

化合物2:白色固體, UV 254nm下有暗斑。[α]D26+20.00° (0.02, MeOH), ESI-MS449 [M+H]+。1H NMR (400MHz, CD3OD):dHppm 6.59 (d, 1H, 1.2Hz), 4.28 (t, 1H, 4.0Hz), 4.21 (dd, 1H, 4.0Hz), 3.84 (s, 1H), 3.42 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 1.90 (m, 2H), 1.16 (s, 3H), 1.05 (d, 3H, 1.2Hz), 1.04 (d, 3H, 4.0Hz), 1.04 (d, 3H, 4.0Hz), 1.03 (d, 3H, 4.0Hz), 0.72 (s, 3H)。

化合物3: 白色固體, UV 254nm下有暗斑。[α]D26?40.00° (0.02, MeOH), ESI-MS470 [M+H]+。1H NMR (400MHz, CD3OD):dHppm 6.57 (d, 1H, 1.6Hz), 5.28~5.30 (m, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 3.62(m, 1H), 3.42 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 1.89 (s, 2H), 1.14 (s, 3H), 1.07 (d, 3H, 4.0Hz), 0.95 (d, 3H, 4.0Hz), 0.88 (d, 3H, 4.0Hz), 0.72 (s, 3H)。

化合物4: 白色固體, UV 254nm下有暗斑, 香草醛濃硫酸加熱顯墨綠色。[α]D26+13.33° (0.03, MeOH), mp. 129~132 ℃, EI MS314 [M]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3):dHppm 5.74 (s, 1H), 2.53 (t,1H, 4.0 Hz), 0.67 (s, 3H), 1.19 (s, 3H), 2.12 (s, 3H);13C-NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 35.7 (t), 33.9 (t), 199.5 (s), 124.0 (d), 171.0 (s), 32.8 (t), 31.9 (t), 35.6 (d), 53.7 (d), 38.6 (s), 21.0 (t), 38.7 (t), 43.9 (s), 56.0 (d), 24.4 (t), 22.9 (t), 63.5 (d), 17.4 (q), 13.3 (q), 209.3 (s), 31.5 (s)。

化合物5:白色固體, mp. 200~203 ℃, UV 254nm下有暗斑, 香草醛濃硫酸顯棕黃色。[α]D20+84.35° (0.147, CHCl3), EI MS 316 [M]+。1H NMR (400MHz, CDCl3):dHppm3.53 (m, 1H), 2.53 (t,1H, 4.0Hz), 0.64 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 2.12 (s,3H);13C NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 38.5 (t), 38.1 (t), 211.9 (s), 44.6 (t), 46.7 (d), 28.8 (t), 31.6 (t), 35.4 (d), 53.7 (d), 35.7 (s),21.4 (t), 38.9 (t), 44.6 (s), 56.5 (d), 24.4 (t), 22.9 (t), 63.8 (d), 11.4 (q), 13.4 (q), 209.6 (s), 31.5 (q)。

化合物6:白色固體, UV 254nm下有暗斑, 香草醛濃硫酸加熱顯墨綠色。[α]D26+45.95° (0.037, CHCl3), EI MS316 [M]+。1H NMR (400 MHz, CDCl3):dHppm 5.35 (t, 1H, 4.0Hz), 2.53 (t,1H), 0.64 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 2.11 (s, 3H);13C NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 38.9 (t), 31.6 (t), 71.7 (d), 37.3 (t), 140.8 (s), 121.4 (d), 31.8 (t), 31.9 (d), 54.2 (d), 36.5 (s), 21.2 (t), 38.8 (t), 44.0 (s), 56.9 (d), 24.5 (t), 22.8 (t), 63.7 (d), 19.4 (q), 13.2 (q), 209.5 (s), 31.6 (q)。

化合物7:白色固體, UV 254nm下有暗斑, 香草醛濃硫酸加熱顯墨綠色。[α]D26+12.00° (0.05, MeOH), mp. 194~196℃, EI MS318 [M]+。1H NMR (400MHz, CDCl3):dHppm 3.59 (m, 1H), 2.52 (t, 1H, 4.0Hz), 0.60 (s, 3H), 0.81 (s, 3H), 2.11 (s,3H);13C NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 37.0 (t), 32.0 (t), 71.2 (d), 39.1 (t), 44.8 (d), 28.6 (t), 32.0 (t), 31.4 (d), 50.0 (d), 35.5 (s), 21.2 (t), 39.1 (t), 44.2 (s), 56.7 (d), 24.4 (t), 22.8 (t), 63.8 (d), 12.3 (q), 13.4 (q), 209.6 (s), 31.4 (q)。

化合物8:無色針狀晶體, 香草醛濃硫酸加熱顯紫紅色。mp. 179~180 ℃, [α]D25?45.00° (1.0, C5H5N)。1H NMR (400 MHz, CDCl3):dHppm -0.13 (1H, dd, 4.0Hz, 4.0Hz), 0.17 (m, 1H), 0.23 (1H, dd, 8.0Hz, 8.0Hz), 0.45 (dd, 1H, 4.0Hz, 4.0Hz), 0.66 (s, 3H), 0.85 (d, 3H, 6.0Hz), 0.90 (s, 3H), 0.94 (d, 3H, 6.0Hz), 0.95 (d, 3H, H-21, 6.0Hz), 0.95 (d, 3H, 6.0Hz), 1.01 (s, 3H), 1.06 (m, 1H), 1.07 (m, 1H), 1.08 (m, 1H), 1.12 (m, 1H), 1.22 (m, 1H), 1.26 (m, 1H), 1.43 (m, 1H), 1.45 (m, 1H), 1.48 (m, 1H), 1.50 (m, 1H), 1.59 (s, 1H), 1.61 (m, 1H), 1.83 (m, 1H), 1.86 (m, 1H), 1.96 (m, 1H), 1.99 (m, 1H), 2.00 (m, 1H), 2.03 (m, 1H), 2.23 (m, 1H), 2.28 (m, 1H), 3.52 (m, 1H), 5.34 (br d, 4.0Hz, 1H);13C NMR (100MHz, CDCl3):dCppm 140.8 (s), 121.7 (d), 71.9 (d), 58.0 (d), 56.8 (d), 50.8 (d), 50.2 (d), 42.8 (s), 42.4 (t), 39.9 (t), 37.3 (t), 36.6 (s), 35.3 (d), 32.2 (d), 32.0 (d), 32.0 (t), 31.7 (t), 28.3 (t), 25.8 (s), 24.6 (t), 23.9 (t), 22.6 (t), 22.2 (t), 21.5 (t), 21.3 (t), 21.2 (q), 21.1 (q), 19.4 (q), 15.4 (q), 14.3 (q), 11.9 (q)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1: 白色固體, 紫外254nm下有暗斑。[α]D26?10.00° (0.04, MeOH)(Aiello et al, 2003), ESI-MS435 [M+H]+, 分子量434。結(jié)合NMR(27個碳: 4個季碳, 8個CH, 10個CH2, 5個CH3), 確定結(jié)構(gòu)式為C27H46O4, 不飽和度為5。NMR中給出了1個酮羰基信號(dC206.2, s)和一個三取代的雙鍵氫信號(dH6.61, d, 1.2Hz, 1H與dC149.3, s, 137.4, d), 除此外無任何不飽和信息, 故而確定1含有3個環(huán)。NMR的高場部分給出甾體典型18和19角甲基信息:dH1.17 (s, 3H)和0.74 (s, 3H)和3個與次甲基相連的甲基:dH1.04 (d, 3H, 6.4Hz)、0.92 (d, 3H, 6.0Hz)和0.90 (d, 3H, 6.0Hz)。同時還連有兩個連氧次甲基[dH3.63 (m, 1H)、3.50 (m, 1H)和dC69.7 (d)、70.8 (d)]和一個羥甲基[(dH3.50 (m, 1H)和dC59.2 (t))。以上信息表明此1可能為斷甾醇類化合物。將1的NMR數(shù)據(jù)與3, 6, 11-三羥基-5-7-烯-9-酮-9, 11-斷甾醇對比(Macnevin et al, 2009), 二者基本一致,確定其結(jié)構(gòu)為3, 6, 11-trihydroxy-5-cholest-9, 11-seco-7-en-9-one。

化合物2為白色固體, 紫外254nm下有暗斑。[α]D26+20.00° (0.02, MeOH)(Liu et al, 2014), ESI-MS449 [M+H]+, 分子量448。與1相比, 2的1H NMR與其極其相似, 低場有相同的雙鍵信息: 6.59 (d, 1H, 1.2Hz), 4.21 (dd, 1H, 4.0Hz)。不同的是高場有6個甲基信號:dH1.16 (s, 3H), 1.05 (d, 3H, 1.2Hz), 1.04 (d, 3H, 1.2Hz), 1.04 (d, 3H, 4.0Hz), 1.03 (d, 3H, 4.0Hz)和0.72 (s, 3H)。比化合物1多了一個與次甲基相連的甲基。將2的NMR數(shù)據(jù)與3, 6, 11-三羥基-5-7-烯-9-酮-9, 11-斷甾醇數(shù)據(jù)對照(Aiello et al, 2003), 二者基本一致, 故而確定2為3, 6, 11-trihydroxy-5cholest-9, 11-seco-7-en-9-one。

化合物3為白色固體, 紫外254nm下有暗斑。[α]D26?40.00° (0.02, MeOH), ESI-MS470 [M+H]+, 分子量469。與1相比, 二者極為相似, 在dH6.57 (d, 1H)和4.20 (m, 1H)處有相似的雙鍵氫信號, 可見其母核是同樣的6位含羥基取代、7位含雙鍵、9位含酮羰基的斷甾醇。而dH5.28~5.30 (m, 2H)顯示3還具有一個雙鍵, 而dH1.90 (s, 3H)顯示該化合物具有一個乙?；?。將3的1H-NMR數(shù)據(jù)與3, 6, 11-三羥基-7, 22()-二烯-9-酮-9, 11斷甾醇對照(Aiello et al, 2003), 二者基本一致, 故而確定其結(jié)構(gòu)為3, 6, 11-trihydroxy-9, 11-seco-5-cholest-7, 22()-dien-9-one。

化合物4為白色固體, 紫外254nm下有暗斑, 香草醛濃硫酸加熱顯墨綠色。[α]D26+13.33° (0.03, MeOH)(Pauli et al, 2010), EI MS給出分子量314(314 [M]+), 結(jié)合13C NMR (21個碳: 5個季碳, 5個CH, 8個CH2和3個CH3), 確定其分子式為C21H30O2, 不飽和度7。NMR給出4具有一個孤立的酮羰基(dC209.3, s)、一個共軛酮羰基(dC199.5, s)和一個三取代雙鍵(dH5.74, s, 1H與dC171.0, s; 124.0, d), 除此外無任何不飽和度信息, 說明其含有4個環(huán)。同時NMR給出甾體類典型的18, 19角甲基信息[dH0.67 (s, 3H)和1.19 (s, 3H)]。暗示化合物4為孕甾烷類化合物。A環(huán)中4-, 5-位雙鍵(dH5.74, s, 1H與dC171.0, s; 124.0, d)由于其與酮羰基共軛, 故而向低場移動23 ppm。NMR中dH6.01 (s, 1H)和dC130.0 (d)、147.2 (s)為甾體3-OH和D4,5類型特征吸收(劉虹等, 2004)。將4的NMR數(shù)據(jù)與4-烯-3, 20-二酮孕甾烷對照(溫燕梅等, 2007; Qi et al, 2008; 柴興云等, 2011), 二者基本一致, 故而鑒定4結(jié)構(gòu)為pregnan- 4-en-3, 20-dione。

化合物5白色固體, 香草醛濃硫酸顯棕黃色, [α]D20+84.35° (0.147, CHCl3), mp. 200~203 ℃。EI MS316 [M]+。結(jié)合NMR(21個碳: 4個季碳, 5個CH, 9個CH2, 3個CH3)確定其分子式為C21H32O2, 不飽和度6。NMR給出了2個孤立酮羰基:dC209.6 (s)和211.9 (s), 除此之外無任何不飽和信息, 故而確定該化合物具有4個環(huán)。同時NMR給出甾體類典型的18和19角甲基信息: (dH0.64, s, 3H; 1.01, s, 3H)。暗示化合物5也為孕甾烷類化合物。將化合物5與4對比, 發(fā)現(xiàn)其極為相似。只是比4少了一個三取代雙鍵信號[dH5.74 (s,1H)dC171.0 (s)、124.0 (d)], 同時其中一個酮羰基的化學(xué)位移值明顯向高場移動了12 ppm (5:dC211.9, s; 4:dC199.5, s), 說明其為孤立酮羰基。將5的NMR數(shù)據(jù)與5-3, 20-二酮孕甾烷對照(Macnevin et al, 2009), 二者基本一致, 故而鑒定化合物5結(jié)構(gòu)為5-pregnan-3, 20-dione。

化合物6亦為白色固體, 紫外254 nm下有暗斑, 香草醛濃硫酸加熱顯墨綠色。[α]D26+45.95° (0.037, CHCl3), EI MS給出分子量316(316 [M]+), 結(jié)合NMR(21個碳: 4個季碳, 6個CH, 8個CH2和3個CH3), 確定其分子式為C21H32O2, 不飽和度6。將化合物6的NMR數(shù)據(jù)與4和5對照發(fā)現(xiàn), 三者十分相似。與5對照只是多了一個三取代雙鍵信息(dH5.35, t, 4.0, 1H;dC121.4, d; 140.8, s)。而與4對比發(fā)現(xiàn)二者的差異在于少了一個共軛酮羰基信息(dC199.5, s), 同時雙鍵的化學(xué)位移值有所變化(4:dH5.74, s, 1H;dC124.0, d; 171.0, s; 6:dH5.35, t, 4.0, 1H;dC121.4, d; 140.8, s)。文獻(xiàn)調(diào)研顯示(Qi et al, 2008), 3-OH,D5,6類型的甾體類化合物的NMR數(shù)據(jù)為(dH5.35, s; 1H;dC121.8, d; 140.7, s)。故確定6的雙鍵應(yīng)該為D5,6類型。將6的NMR數(shù)據(jù)與20-酮孕甾烷對照(溫燕梅等, 2007; Qi et al, 2008; 柴興云等, 2011), 二者基本一致, 故確定6為3-pregnan-hydroxy-5-en-20-one。

化合物7白色固體, 紫外254nm下有暗斑, 香草醛濃硫酸加熱顯墨綠色。[α]D26+12.00° (0.05, MeOH)(Shingate et al. 2011), EI MS給出分子量318(318 [M]+), 結(jié)合NMR(21個碳: 3個季碳, 6個CH, 9個CH2和3個CH3)確定其分子式為C21H34O2, 不飽和度5。將化合物7的NMR數(shù)據(jù)與6對比, 發(fā)現(xiàn)二者相似。只是比6少了一個雙鍵(dH5.35, t, 4.0, 1H;dC121.4, d; 14.8, s), 多了一個連氧次甲基信息(dH3.59, m, 1H;dC71.2, d)。將7的NMR數(shù)據(jù)與3-羥基-5-20-酮孕甾烷對照(溫燕梅等, 2007; Qi et al, 2008; 柴興云等, 2011), 二者基本一致, 故而鑒定7為3-hydroxy-5-pregnan-20-one。

化合物8: 無色針狀晶體, mp. 179~180℃, [α]D25?45.00° (1.0, C5H5N)(Van Minh et al, 2007)。結(jié)合NMR(3個季碳, 10個CH, 9個CH2, 7個CH3), 確定分子式為C30H50O, 不飽和度6。NMR中給出雙鍵信號(dH5.34, br d, 4.0 Hz, 1H與dC140.8, s; 121.7, d), 這是5, 6位雙鍵的典型特征;1H-NMR高場數(shù)據(jù)中(dH0.13, 1H, dd, 4.0Hz, 4.0Hz; 0.17, m, 1H; 0.23, 1H, dd, 8.0Hz, 8.0Hz; 0.45, dd, 1H, 4.0Hz, 4.0Hz), 是環(huán)丙烷邊鏈的信號峰。除此外并無其它任何不飽和信息, 由此確定該化合物具有4個環(huán)。且1H-NMR中給出7個甲基信號: 3個連在季碳上的角甲基(dH0.66, s, 3H; 0.90, s, 3H; 1.01, s, 3H), 4個與次甲基相連的甲基(0.85, d, 3H, 6.0 Hz; 0.94, d, 3H, 6.0Hz; 0.95, d, 3H, 6.0Hz; 0.95, d, 3H, 6.0Hz)。將8 NMR數(shù)據(jù)與柳珊瑚甾醇對比(Ortega et al, 2008), 二者基本一致, 故確定8結(jié)構(gòu)為柳珊瑚甾醇。

3 結(jié)果與討論

所有化合物均首次從屬柳珊瑚中得到。此研究結(jié)果為南海的進(jìn)一步開發(fā)提供了物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ), 豐富了柳珊瑚的化學(xué)成分多樣性。化合物1~3屬于斷甾醇類化合物, 大多具有體外細(xì)胞毒活性(如K562, HL-60, A549, HCT-116和HeLa)(Liu et al, 2014)。2在3.00μg·mL-1條件下具有增加成骨細(xì)胞MC3T3-E1的生長、診斷堿性磷酸酶和礦化結(jié)節(jié)的活性(Van Minh et al, 2007)。構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)(Liu et al, 2014), 此系列化合物在IC50值為1.09~8.12μg·mL-1時, 對人體白血病K562細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性; 3-位的羥基是其細(xì)胞毒活性的基礎(chǔ), 6-位、11-位的羥基乙?；苁辜?xì)胞毒活性增強(qiáng)?；衔?~7從化學(xué)結(jié)構(gòu)講均屬于孕甾酮類, 為天然來源的孕甾酮類化合物。此類化合物具有抗污損和抗細(xì)菌(對海洋來源的15株細(xì)菌菌株具有抑制其生長的作用)等生態(tài)和生物活性(Qi et al, 2008)。臨床和臨床前研究(Ortega et al, 2008)表明, 外傷性腦損傷在荷爾蒙孕酮類物質(zhì)急性給藥時, 能極大的減小其導(dǎo)致的腦水腫、炎癥、組織壞死、編程性細(xì)胞死亡等不良后果, 然而其水溶性不佳成為限制其發(fā)揮治療作用的障礙; 而天然得到的孕甾酮解決了其溶解性問題, 并在外傷性腦損傷(TBI)中發(fā)揮了重要的治療作用。柳珊瑚甾醇生理活性實(shí)驗(yàn)(歐云付等, 2011)表明其具有明顯的抗心律失常和減慢心率等作用。盡管文獻(xiàn)報(bào)道此類化合物具有抗腫瘤、抗菌和抗污活性, 但在濃度為50.00μg·mL-1時, 所有單體化合物在克服非小細(xì)胞肺癌腫瘤耐藥(NCI-H1975/GR)方面未表現(xiàn)出任何活性。目前生物污染給全球海運(yùn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失, 大多海洋生物附著在輪船、艦艇水體表面(如藤壺, 貽貝, 管蟲和海藻等)給海運(yùn)業(yè)上造成嚴(yán)重生物污染問題(Aiello et al, 2003)。目前常見防污劑中三丁基錫(TBI)最有效但同時也具有高毒性, 非選擇性地殺死海洋生物和傷害非目標(biāo)生物。有研究表明(Li et al, 2013)海洋生物可以產(chǎn)生自身去污成分, 如從柳珊瑚分離的萜類、類固醇和聚酮等是一種極好的來源無毒防污化合物。初步構(gòu)效關(guān)系研究表明呋喃環(huán)部分對防污活性都很重要, 同時羥基的存在增強(qiáng)了它們的抗沉降活性(Li et al, 2013)。許多海洋生物(如柳珊瑚, 軟珊瑚, 海綿和海藻)能有效地抵御掠食者, 競爭者和潛力病原體(Moritz et al, 2014), 能抑制海洋細(xì)菌的生長和藤壺幼蟲的沉降(Qi et al, 2008)?？傊? 在這項(xiàng)研究中我們首次從柳珊瑚中分離鑒定具有一系列生物活性的化合物, 值得進(jìn)一步探索無毒天然防污化合物。

柴興云, 胡靜, 黃暉, 等, 2011. 小月柳珊瑚中孕甾烷類的化學(xué)成分研究[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào), 30(1): 127–130. CHAI XINGYUN, HU JING, HUANG HUI, et al, 2011. Pregnane steroids from a gorgoniansp. in South China Sea[J]. Journal of Tropical Oceanography, 30(1): 127–130 (in Chinese with English abstract).

柴興云, 唐力英, 雷輝, 等, 2012. 柳珊瑚化學(xué)成分與生物活性研究新進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志, 37(5): 667–685. CHAI XINGYUN, TANG LIYING, LEI HUI, et al, 2012. Most advance on chemical and biological investigations of gorgonian octocorals[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 37(5): 667–685 (in Chinese with English abstract).

高程海, 方燕, 易湘茜, 等, 2013. 中國柳珊瑚萜類化合物研究新進(jìn)展[J]. 廣西科學(xué)院學(xué)報(bào), 29(2): 108–113. GAO CHENGHAI, FANG YAN, YI XIANGXI, et al, 2013. Advances in studies on terpenoids and their bioactivities from Gorgonian[J]. Journal of Guangxi Academy of Sciences, 29(2): 108–113 (in Chinese with English abstract).

劉虹, 蘇鏡娛, 曾隴梅, 2004. 豆莢軟珊瑚sp.中的次生代謝產(chǎn)物研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 43(1): 122–124. LIU HONG, SU JINGYU, ZENG LONGMEI, 2004. Studies on the secondary metabolites of the soft coralsp.[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 43(1): 122–124 (in Chinese with English abstract).

歐云付, 尹平河, 徐石海, 等, 2011. 南海圓形短指軟珊瑚的化學(xué)成分[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 28(6): 3293–3297. OU YUNFU, YIN PINGHE, XU SHIHAI, et al, 2011. Chemical constituents in round short refers to soft coralfrom South China Sea[J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory, 28(6): 3293–3297 (in Chinese with English abstract).

溫燕梅, 漆淑華, 張偲, 2007. 南海脆燈蕊柳珊瑚化學(xué)成分的研究[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào), 26(1): 73–77. WEN YANMEI, QI SHUHUA, ZHANG SI, 2007. Studies on chemical constituents of gorgonianfrom South China Sea[J]. Journal of Tropical Oceanography, 26(1): 73–77 (in Chinese with English abstract).

AIELLO A, ESPOSITO G, FATTORUSSO E, et al, 2003. Aplidiasterols A and B, two new cytotoxic 9,11-secosterols from the mediterranean ascidian[J]. Steroids, 68(9): 719–723.

BLUNT J W, COPP B R, KEYZERS R A, et al, 2014–2018. Marine natural products[J]. Natural Product Reports, 31(2): 160–258, 32(2): 116–211, 33(3): 382–431, 34(3): 235–294, 35(1): 8–53.

BOONANANWONG S, KONGKATHIP B, KONGKATHIP N, 2008. First synthesis of 3,16,20-polyoxygenated cholestanes, new cytotoxic steroids from the gorgonian[J]. Steroids, 73(11): 1123–1127.

CIMINO G, DE ROSA S, DE STEFANO S, et al, 1984. C-18 Hydroxy steroids from the Mediterranean gorgonian[J]. Experientia, 40(3): 246–248.

GARRIDO L, ZUBI?A E, ORTEGA M J, et al, 2000. Isolation and structure elucidation of new cytotoxic steroids from the gorgonian[J]. Steroids, 65(2): 85–88.

GUTIéRREZ M, CAPSON T L, GUZMáN H M, et al, 2005. Leptolide, a new furanocembranolide diterpene from[J]. Journal of Natural Products, 68(4): 614– 616.

KEYZERS R A, GRAY C A, SCHLEYER M H, et al, 2006. Malonganenones A-C, novel tetraprenylated alkaloids from the Mozambique gorgonian[J]. Tetrahedron, 62(10): 2200–2206.

KINGSLEY R J, CORCORAN M L, KRIDER K L, et al, 2001. Thyroxine and vitamin D in the gorgonian[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 129(4): 897–907.

KSEBATI M B, CIERESZKO L S, SCHMITZ F J. 1984. 11, 12-Epoxypukalide, a furanocembranolide from the gorgonian[J]. Journal of Natural Products, 47(6): 1009–1012.

LI YONGXIN, WU HUIXIAN, XU YING, et al, 2013. Antifouling activity of secondary metabolites isolated from Chinese marine organisms[J]. Marine Biotechnology, 15(5): 552–558.

LIU MIN, SHAO CHANGLUN, CHEN MIN, et al, 2014. Bioactive 9,11-secosteroids from gorgoniancollected from the South China Sea[J]. Chemistry & Biodiversity, 11(7): 1109–1120.

MACNEVIN C J, ATIF F, SAYEED I, et al, 2009. Development and screening of water-soluble analogues of progesterone and allopregnanolone in models of brain injury [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 52(19): 6012–6023.

MIRALLèS J, BARNATHAN G, GALONNIER R, et al, 1995. New branched-chain fatty acids from the Senegalese gorgonian(white and yellow morphs)[J]. Lipids, 30(5): 459–466.

MORITZ M I G, MAROSTICA L L, BIANCO é M, et al, 2014. Polyoxygenated steroids from the octocoralandevaluation of their cytotoxic activity[J]. Marine Drugs, 12(12): 5864–5880.

ORTEGA M J, ZUBíA E, SáNCHEZ M C, et al, 2008. Cembrane diterpenes from the gorgonian[J]. Journal of Natural Products, 71(9): 1637–1639.

PAULI G F, FRIESEN J B, G?DECKE T, et al, 2010. Occurrence of progesterone and related animal steroids in two higher plants[J]. Journal of Natural Products, 73(3): 338–345.

QI S H, ZHANG S, YANG L H, et al, 2008. Antifouling and antibacterial compounds from the gorgoniansand[J]. Natural Product Research, 22(2): 154–166.

SHINGATE B B, HAZRA B G, SALUNKE D B, et al, 2011 Stereoselective synthesis and antimicrobial activity of steroidal C-20 tertiary alcohols with thiazole/pyridine side chain[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 46(9): 3681–3689.

VAN MINH C, CUONG N X, TUAN T A, et al, 2007. A new 9,11-secosterol from the Vietnamese sea soft coral,, increases the function of osteoblastic MC3T3-E1 cells[J]. Natural Product Communications, 2(11): 1095–1100.

Research on Sterols from

XIAO Xiji, DENG Yun, XIE Lufeng, ZHANG Qi, WEI Xia, YU Xin, ZHANG Cuixian

School of Pharmaceutical Science, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, 510006, China

Research was carried out on novel secondary metabolites fromcollected from the South China Sea. The secondary metabolites were isolated by silica gel column chromatography, ODS, Sephadex LH-20, thin layer chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC). The structures of compounds were identified by nuclear magnetic resonance spectrum (NMR), mass spectrum (MS), and literature analysis. Eight sterols were obtained and elucidated as follows: 3, 6, 11-trihydroxy-24-methyl-5-chloest-9, 11-seco-7-en-9-one (1); 3, 6, 11-trihydroxy-24- methyl-5-chloest-9, 11-seco-7-en-9-one (2); 3, 6, 11-tri- hydroxy-5-chloest-9, 11-seco-7, 22()- dien-9-one (3); pregnan- 4-en-3, 20-dione (4); 5-pregnan-3, 20-dione (5); 3-hydroxy- pregnan-5-en-20-dione (6); 3-hydroxy-5-pregnan-20-one (7); and Gorgosterol (8). All the sterols were first obtained from.

; secondary metabolites; secosterols; identification

date: 2018-11-21;

date: 2019-01-04.

National Natural Science Foundation (81741160); Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (2015A020216017, 2017A020217008); The Fire Plan Project of the Guangzhou University of Chinese Medicine (XH20170110); Open Subject of State Key Laboratory of Marine Resources Utilization in the South China Sea of Hainan University (2016003); Natural Science Foundation of Guangdong Province (2014A030313411)

ZHANG Cuixian. E-mail: zhangcuixian@aliyun.com

O629.7; P735

A

1009-5470(2019)04-0064-6

10.11978/2018125

http://www.jto.ac.cn

2018-11-21;

2019-01-04。

孫淑杰編輯

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81741160); 廣東省科技計(jì)劃(2015A020216017、2017A020217008); 廣州中醫(yī)藥大學(xué)“薪火計(jì)劃”重點(diǎn)項(xiàng)目(XH20170110); 海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2016003); 廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313411)

肖細(xì)姬(1983—), 女, 助理實(shí)驗(yàn)師, 研究方向: 藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-Mail: xiaoxiji@gzucm.edu.cn

張翠仙(1975—), 女, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向: 天然藥物化學(xué)。E-Mail: zhangcuixian@aliyun.com

Editor: SUN Shujie