嬰幼兒乳粉和米粉中阪崎克羅諾桿菌的耐受性研究

曹晨陽 孟令緣 王嘉煒 趙曉陽 楊保偉

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100）

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種革蘭氏陰性致病菌，常污染乳及乳制品，可引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和敗血癥，死亡率高達(dá)50%以上[1-3]。即使治愈，也可能使神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生后遺癥[4]。近幾年，隨著國內(nèi)外一系列與阪崎克羅諾桿菌相關(guān)的污染事件的爆發(fā)，該菌受到研究者的廣泛關(guān)注[5-8]。目前，對阪崎克羅諾桿菌確切的污染來源尚不清楚，許多病例表明嬰幼兒配方乳粉是該菌的主要感染載體[9]。

如果嬰幼兒進(jìn)食染菌的乳粉和米粉，該菌則隨食物進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)，導(dǎo)致疾病。嬰幼兒乳粉/米粉沖調(diào)時(shí)使用溫水和/或微波加熱，這樣的處理肯定會或多或少的對菌體產(chǎn)生影響。乳粉/米粉沖調(diào)時(shí)，其中的阪崎克羅諾桿菌沒有被高溫和/或微波殺死，隨著食物進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)后，消化系統(tǒng)（特別是胃液）的pH值、腸道中的乳酸菌或發(fā)生腹瀉后服用媽咪愛等嬰幼兒常用藥物也會對該菌的生長產(chǎn)生一定的抑制或殺滅作用。雖然上述因素均會在一定程度抑制外源污染的阪崎克羅諾桿菌，甚至殺滅菌體，但目前除了對該菌的耐熱性能研究較多外[10-14]，尚無研究揭示阪崎克羅諾桿菌對其它因素的耐受性。本研究基于嬰幼兒進(jìn)食乳粉/米粉時(shí)常規(guī)操作和部分人體生理?xiàng)l件，闡明阪崎克羅諾桿菌對這些條件的耐受性，為指導(dǎo)乳粉/米粉合理沖調(diào)和保障嬰幼兒食品安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-894由中國食品藥品檢定研究院提供，分離于嬰幼兒配方乳粉和米粉中不同基因型的阪崎克羅諾桿菌 11-19（1）、12-4（1）、12-8（1）、12-13（2）、13-8（2）、13-2（1）、14-20（1）、14-15（2）、14-4（1）、15-9（2）、18-16（1）、18-8（1）、18-24（1）、18-12（2）和18-14（1）由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物研究室提供。供試代表性菌株選擇標(biāo)準(zhǔn)：分離于不同時(shí)間采集的不同品牌的嬰幼兒乳粉或米粉，具有不同耐藥表型和基于脈沖場 凝 膠 電 泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）的基因型，攜帶不同毒力基因。產(chǎn)乳酸菌素乳酸菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院呂欣博士惠贈(zèng)。

1.1.2 材料與試劑 LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基（MHA）和腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；媽咪愛，購自北京韓美藥品有限公司；制作菌懸液用嬰幼兒配方乳粉，購于陜西楊陵好又多超市，為適于較大嬰兒及幼兒食用的2段配方牛乳粉。

1.1.3 主要儀器 高壓滅菌鍋（LAC-5080S），上海博訊；超凈工作臺（SW-CJ-1CU），蘇州泰安；微量移液槍（Effendorf），德國；百分之一天平（XS204），梅特勒；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-211B），上海智誠。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化和擴(kuò)大培養(yǎng) 用接種環(huán)分別蘸取少量保存于-80℃ LB肉湯/甘油（50%/50%V/V）中的阪崎克羅諾標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株，劃線接種到LB瓊脂培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)18～24 h。從LB培養(yǎng)基上挑取一個(gè)單菌落，接種到20 mL BHI肉湯中，37℃、100 r/min下?lián)u床培養(yǎng)10 h。

1.2.2 菌液初始濃度測定和存活率計(jì)算 取1 mL阪崎克羅諾桿菌BHI肉湯培養(yǎng)物，用生理鹽水依次進(jìn)行 10倍稀釋，分別得到其 101，102，103，104，105和106倍稀釋液。分別取各稀釋液50 μL接種于LB平板上，涂布均勻后37℃下倒置培養(yǎng)18 h，計(jì)數(shù)。同時(shí)接種50 μL無菌生理鹽水于LB平板表面作為陰性對照。每個(gè)稀釋度（包括對照）共做3個(gè)重復(fù)。選擇菌落分布均勻且皿內(nèi)菌落數(shù)在30～300 CFU的稀釋度的菌落數(shù)計(jì)算菌液的起始濃度。

存活率計(jì)算按照下列公式進(jìn)行：

1.2.3 阪崎克羅諾桿菌對溫度的耐受性測定 結(jié)合日常生活中乳粉沖調(diào)時(shí)使用的水溫，分別選取50，60和70℃ 3個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行研究。取1.2.1節(jié)中的BHI肉湯培養(yǎng)物1 mL加入到滅菌的裝有10 mL沖調(diào)乳粉（用礦泉水按照乳粉生產(chǎn)商的推薦比例沖調(diào)，下同）的50 mL離心管中，振蕩混勻，將離心管分別置于50，60和70℃的水浴中保溫處理20 min，保溫過程不斷進(jìn)行振蕩使菌體受熱均勻。處理結(jié)束后，按照1.2.2節(jié)所述方法，立即取樣測定阪崎克羅諾桿菌的濃度并計(jì)算存活率，采用存活率衡量其對溫度的耐受性。

1.2.4 阪崎克羅諾桿菌對pH的耐受性測定 將沖調(diào)好的乳粉高溫滅菌后，使用無菌HCl和/或NaOH調(diào)整其pH 為4.0，6.0和8.0，確定每個(gè)離心管中調(diào)整pH值后的乳粉體積為20 mL后，分別向其中加入1 mL 1.2.1節(jié)中的BHI肉湯培養(yǎng)物，振蕩勻后室溫下靜置20 min。處理結(jié)束后，按照1.2.2節(jié)所述方法，立即取樣測定阪崎克羅諾桿菌的濃度并計(jì)算存活率，采用存活率衡量其對pH的耐受性。

1.2.5 阪崎克羅諾桿菌對微波處理的耐受性 取1 mL 1.2.1節(jié)中的BHI肉湯培養(yǎng)物，加入沖調(diào)好的10 mL無菌乳粉中。由預(yù)試驗(yàn)可知，10 mL沖調(diào)乳粉在微波爐中加熱到60℃所需時(shí)間大約為2 min。通過秒表計(jì)時(shí)，對所有加有菌液的沖調(diào)奶粉進(jìn)行微波處理2 min后，立即取樣測定阪崎克羅諾桿菌的濃度并計(jì)算存活率，采用存活率衡量其對微波的耐受性。

1.2.6 阪崎克羅諾桿菌對乳酸菌的敏感性 首先向無菌培養(yǎng)皿底部平鋪一層厚度約2 mm的乳酸菌培養(yǎng)基（de Man Rogosa Sharpe，MRS），待其凝固后，以劃線法在培養(yǎng)基中間接種已經(jīng)活化的乳酸菌，共劃線2條。之后將100 μL 1.2.1節(jié)中培養(yǎng)得到的阪崎克羅諾桿菌菌液加入10 mL已滅菌并冷卻至50℃的MHA培養(yǎng)基中，振蕩混勻后水平傾注于MRS固體培養(yǎng)基上，凝固后于37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察抑菌結(jié)果。采用垂直于乳酸菌劃線方向抑菌區(qū)域的最大半徑表示阪崎克羅諾桿菌的敏感性。

1.2.7 阪崎克羅諾桿菌對媽咪愛的敏感性 將購買的媽咪愛在LB肉湯中振蕩過夜培養(yǎng)，備用。采用牛津杯法測定阪崎克羅諾桿菌對媽咪愛的敏感性，即：先在無菌培養(yǎng)皿底部平鋪一層10‰的無菌瓊脂，待瓊脂凝固后，在其上方均勻放置4個(gè)無菌的牛津杯，再向皿內(nèi)倒入適量的已滅菌并冷卻至55℃左右的MHA培養(yǎng)基，待其冷卻凝固后，使用涂布法將 100 μL（濃度約 108CFU/mL）阪崎桿菌菌液均勻涂布在MHA培養(yǎng)基表面。當(dāng)液體被培養(yǎng)基充分吸收后，再用無菌鑷子沿垂直于培養(yǎng)基的方向拔掉牛津杯，向牛津杯形成的孔洞中加入約100 μL媽咪愛培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)18～20 h后測量抑菌圈直徑。采用抑菌圈直徑和牛津杯外徑的比值表示阪崎克羅諾桿菌的敏感性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0對不同溫度、pH、微波條件下阪崎克羅諾桿菌的存活率和對媽咪愛及乳酸菌的敏感性結(jié)果進(jìn)行方差分析、多重比較（Tukey法）和卡方檢驗(yàn)，得到阪崎克羅諾桿菌的耐受性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌對溫度的耐受性

阪崎克羅諾桿菌經(jīng)50，60和70℃處理后的存活率見表1。50℃處理后，除12-8（1）和14-15（2）死亡較多外，其它菌株基本沒有死亡，大部分菌株反而呈生長態(tài)勢。當(dāng)溫度上升到60℃時(shí)，所有菌株都呈現(xiàn)出死亡的趨勢。70℃時(shí)，所有菌株的存活率都低于0.11%。對3種溫度處理后阪崎克羅諾桿菌濃度的對數(shù)值方差分析和多重比較（表2，表3）結(jié)果表明：50，60與70℃處理后菌株的存活率具有極顯著差異。

表1 溫度耐受試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of anti-thermal test

表2 溫度耐受試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 2 Results of variance analysis of anti-thermal test

表3 不同溫度處理后存活率多重比較結(jié)果Table 3 Results of multiple comparison of survival rate at different temperatures

2.2 阪崎克羅諾桿菌對不同pH條件的耐受性

供試菌株在pH 4.0，6.0和8.0條件下處理后的存活率見表4。3種pH條件處理后，大部分菌株出現(xiàn)不同程度死亡。13-2（1）的死亡率均相對較高，說明該菌對 pH 比較敏感。18-8（1）、18-16（1）和18-12（2）經(jīng)pH處理后還出現(xiàn)增長態(tài)勢，表明對pH的耐受性非常強(qiáng)。

阪崎克羅諾桿菌經(jīng)3種pH處理后存活率方差分析和多重比較結(jié)果（表5，表6）表明：pH 4.0條件處理與pH 6.0和pH 8.0條件處理后菌液濃度的對數(shù)值在1%水平上存在極顯著差異。pH 6.0與pH 8.0條件處理后菌株存活率無顯著性差異。

表4 酸堿耐受性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of anti-acid and anti-alkaline test

表5 酸堿耐受性試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis of anti-acid and anti-alkaline test

表6 不同pH處理后存活率多重比較結(jié)果Table 6 Results of multiple comparison of survival rate at different pH

2.3 阪崎克羅諾桿菌對微波處理的耐受性

微波處理對菌株存活率的影響主要體現(xiàn)在微波的殺菌作用，只要微波劑量足夠，菌株基本都會死亡。研究中大部分菌株的死亡率高達(dá)99%（表7），卡方檢驗(yàn)的結(jié)果表明供試菌株的存活率間無顯著性差異（P＞0.05），即微波的殺滅作用較為普遍。

表7 微波處理后阪崎克羅諾桿菌的存活率Table 7 Survival rates of Cronobacter sakazakii after microwave treatment

2.4 阪崎克羅諾桿菌對乳酸菌的敏感性

乳酸菌在生長過程中會代謝產(chǎn)生具有抑菌活性的乳酸菌素，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌均有一定的抑制作用[15]。乳酸菌對阪崎克羅諾桿菌抑制的最大半徑見表8。菌株12-4（1）對乳酸菌最敏感，而 14-4（1）和15-9（2）的耐受性較強(qiáng)，表明產(chǎn)乳酸菌素的乳酸菌對阪崎克羅諾桿菌生長具有一定的抑制，多重比較結(jié)果表明不同菌株對乳酸菌的敏感性具有極顯著的差異。

2.5 阪崎克羅諾桿菌對媽咪愛的敏感性

研究中牛津杯外徑（即加樣孔直徑）為9.0 mm，抑菌圈直徑及其與加樣孔直徑的比值如表9所示。由表9可知，媽咪愛對供試阪崎克羅諾桿菌均有一定程度的抑制作用。18-16（1）對媽咪愛最為敏感，18-8（1）相對不敏感，多重比較結(jié)果表明除部分菌株對媽咪愛的敏感程度存在極顯著的差異外，其它菌株的敏感性較為相似。

表8 阪崎克羅諾桿菌對乳酸菌的敏感性Table 8 Sensitivity of Cronobacter sakazakii to Lactobacillus

表9 阪崎克羅諾桿菌對媽咪愛的敏感程度Table 9 Sensitivity of Cronobacter sakazakii to Mamiai

3 討論

阪崎克羅諾桿菌是一種常見的食源性條件致病菌，在嬰幼兒乳粉、米粉、奶酪、面包及豆腐等多種食品中均被檢出[16]。自Muytjens等[17]于1983年從沖調(diào)乳粉的器具上分離到阪崎克羅諾桿菌，繼而將其與嬰幼兒乳粉聯(lián)系起來后，世界多地，如：美國、丹麥、冰島和新西蘭等，均出現(xiàn)了由阪崎克羅諾桿菌引起的疾病暴發(fā)[18]。2011年，在美國俄克拉馬州和密蘇里州相繼發(fā)生了嬰兒感染阪崎克羅諾桿菌致死的事件，之后，美國的沃爾瑪超市及一些零售商開始大規(guī)模召回嬰幼兒乳粉[19]。這些事件的爆發(fā)表明研究與乳粉密切相關(guān)的阪崎克羅諾桿菌具有十分重要的意義。

研究中供試菌株為分離于不同時(shí)間、不同市場類型和城市中采集的不同品牌或批次的嬰幼兒乳粉或米粉，這些菌株藥敏性、基因型和攜帶的毒力基因均不相同，具有一定的代表性。研究中測試的溫度和微波處理均為日常生活中乳粉和米粉沖調(diào)時(shí)常用的水溫和加熱處理方式，測試pH范圍與嬰幼兒胃液相當(dāng)，因此研究這些理化條件對已經(jīng)污染到食品中的阪崎克羅諾桿菌生存的影響具有一定的理論和實(shí)際指導(dǎo)意義。

目前，針對阪崎克羅諾桿菌對熱及酸堿的耐受性研究較多，在國內(nèi)，陳彬等[20]（2008）發(fā)現(xiàn)，分離自奶制品中的阪崎腸桿菌對高溫都有相當(dāng)?shù)哪褪苄?，用高?0℃的水沖調(diào)奶粉時(shí)，奶粉中阪崎腸桿菌的數(shù)量會至少減少4個(gè)數(shù)量級。姜琛璐等[13]（2014）研究發(fā)現(xiàn)，分離自重慶17個(gè)區(qū)縣嬰幼兒食品中的阪崎腸桿菌對50℃均表現(xiàn)出一定的耐受性，大部分菌株在60時(shí)死亡，70℃下所有菌株基本迅速失活。在國外，Breeuwer等[21]（2003）對分離自農(nóng)場的阪崎腸桿菌的耐受性研究也表明其對熱具有一定的耐受性。本研究在70℃條件下處理20 min，所有菌株的存活率都不高于0.11%，與上述結(jié)果基本一致。

對于阪崎克羅諾桿菌耐酸堿性的研究，姜琛璐[13]（2014）、柴云雷[22]（2014）和袁飛等[8]（2005）所得結(jié)果類似，設(shè)計(jì)的條件均在pH不高于2.0且不低于12.0的范圍內(nèi)，與本研究采用的范圍不同。人體胃液的pH值約為0.9～1.5，小腸的pH值范圍較廣，為4.8～8.2[23]，而嬰幼兒的胃液 pH值偏高[24]，新生兒正常胃液的pH值為5～6.8[25]，其中母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒胃液pH值約為2.7±0.3，奶粉喂養(yǎng)的嬰幼兒為 3.6±0.2[26]，故選取 pH 4.0，6.0和8.0 3個(gè)條件。本研究中pH 4.0處理后存活率與其它2組具有極顯著的差異，即：如果大量阪崎克羅諾桿菌進(jìn)入嬰幼兒體內(nèi)，除了胃液可能會殺死部分菌株外，侵入其他組織的菌株很難被完全殺死，與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-894存活率比較，可推測在同等條件下，pH同為4.0時(shí)，供試菌株的致病風(fēng)險(xiǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)菌株。

微波殺菌是非熱效應(yīng)和熱效應(yīng)共同作用的結(jié)果[27]，本研究主要考慮用微波爐加熱乳粉和/或米粉時(shí)微波的非熱效應(yīng)對于阪崎克羅諾桿菌的殺滅作用。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，使用研究開展實(shí)驗(yàn)室的微波爐加熱10 mL乳粉到60℃需要2 min，而之前溫度耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明60℃對阪崎克羅諾桿菌的殺滅作用不明顯，故對供試菌株微波處理2 min，可以在一定程度上排除微波熱效應(yīng)的影響。微波對阪崎克羅諾桿菌的殺滅作用尚無明確的報(bào)道，王紹林等[28]（1993）驗(yàn)證了微波殺菌非熱效應(yīng)的觀點(diǎn)，王冬等[29]（2007）研究表明微波可以抑制并殺滅霉菌，肖平等[30]（2007）研究表明在一定火力范圍內(nèi)，鮮乳中細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)均隨微波火力的增強(qiáng)而減少。本研究中，對阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行微波處理，驗(yàn)證了微波的非熱效應(yīng)對該菌的殺滅作用明顯，且供試菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株存活率間無顯著性差異，為嬰幼兒乳粉沖調(diào)提供指導(dǎo)，也為后續(xù)研究提供參考。

除理化因素對阪崎克羅諾桿菌有一定的抑制作用外，生物因素也對其有一定的影響。健康人體腸道中常駐有乳酸菌，即使乳粉或米粉中污染的阪崎克羅諾桿菌未在沖調(diào)過程被殺死，隨食品進(jìn)入腸道后，腸道內(nèi)乳酸菌也會對其產(chǎn)生拮抗或抑制作用。杜靜芳等[31]（2016）在篩選和鑒定拮抗阪崎腸桿菌乳酸菌時(shí)，采用雙層瓊脂擴(kuò)散法產(chǎn)生抑菌圈直徑大小來衡量該乳酸菌對阪崎腸桿菌的抑制作用，其抑菌圈直徑最大為19.89 mm。吳玲等[32]（2011）采用管碟法對分離自泡菜中的乳酸菌對阪崎腸桿菌的抑制作用結(jié)果表明乳酸菌對其具有一定的抑制作用，其抑菌圈直徑最大為16.2 mm。本研究采用的抑菌方法有所不同，但結(jié)果基本一致，不同菌株對乳酸菌的敏感程度有明顯差異，腸道內(nèi)乳酸菌可能不會完全殺死進(jìn)入腸道的阪崎桿菌。當(dāng)嬰幼兒由于阪崎克羅諾桿菌進(jìn)入其體內(nèi)引起腹瀉后，會服用媽咪愛等微生態(tài)制劑類嬰幼兒藥物，其主要成分為糞鏈球菌和枯草桿菌。鐘有添等[33]（2006）研究了媽咪愛對腸道致病菌、條件致病菌及其L型的抑菌作用，結(jié)果表明媽咪愛在體外對大腸埃希菌、福氏志賀菌、傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、自假絲酵母菌及其L型皆有不同程度的抑菌作用，并且濃度越大，抑菌作用越強(qiáng)。目前，媽咪愛對阪崎克羅諾桿菌的抑制作用的研究尚未報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株與大部分供試菌株對媽咪愛的敏感程度較為相似，媽咪愛對阪崎克羅諾桿菌引起的疾病有一定的治療效果。

嬰幼兒食品安全問題已成為當(dāng)前人們最關(guān)注的食品安全問題之一。研究阪崎克羅諾桿菌對溫度、酸堿及微波的耐受性，這將為嬰幼兒乳粉/米粉的合理沖調(diào)提供指導(dǎo)，了解其對乳酸菌和媽咪愛的敏感性，有助于保障嬰幼兒食品安全及嬰幼兒身體健康。另外，獲得阪崎克羅諾桿菌對微波的耐受性及對媽咪愛的敏感性結(jié)果，可以為日后研究微波的非熱效應(yīng)及微生態(tài)制劑對阪崎克羅諾桿菌的殺滅作用提供理論基礎(chǔ)。