海洋酵母自溶突變株生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白及其組分分析

趙春海李 文張 瞳 池振明 王志鵬

（1濱州職業(yè)學(xué)院 山東濱州 256603

2中國海洋大學(xué) 山東青島 266000

3中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 山東青島 266071）

單細(xì)胞蛋白（single cell protein SCP）通常是指來源于藻類、酵母、真菌或細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)，已應(yīng)用在食品工業(yè)和動物飼料工業(yè)上。SCP單細(xì)胞可以追到1966年，由威爾遜學(xué)院卡羅爾命名。單細(xì)胞蛋白的發(fā)展是隨著微生物發(fā)酵廢料（包括木材、稻草、罐頭食品，食品加工廢料，纖維、酒精生產(chǎn)下腳料或人類及動物的排泄物）而發(fā)展起來的[1-6]。

產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物種類很多，如多種海洋微藻、細(xì)菌、酵母、霉菌[7-9]。作為單細(xì)胞蛋白的酵母細(xì)胞優(yōu)于其它微生物細(xì)胞。Rhishipal等[10]在印度的柯欽港淺海海岸分離到多株海洋酵母菌，并將其培養(yǎng)在含有蝦殼的廢料中，經(jīng)海洋假絲酵母M15轉(zhuǎn)化發(fā)酵處理，蝦殼終產(chǎn)物中蛋白含量由38.5%增加到70.4%。Brown等[11]發(fā)現(xiàn)并分離到幾株海洋酵母（Debaryomyces hansenii ACM 4784，Dipodascus capitatus ACM 4779和Dipodascus sp.ACM 4780）的蛋白含量分別為23%，32%，36%，海洋酵母細(xì)胞中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，蛋白質(zhì)的含量高且質(zhì)量好，除蛋白質(zhì)外還含有糖類，主要來源于酵母細(xì)胞壁的多糖，尤其是還含有一種具有免疫活性的多糖類物質(zhì)，能增強(qiáng)海產(chǎn)動物的抵抗力；然而其缺少二十碳五烯酸，二十碳六烯酸[11]，使海洋酵母單細(xì)胞蛋白不能用于種苗的飼養(yǎng)。

目前作者研究發(fā)現(xiàn)金黃色引球酵母G7a能夠在多種碳源培養(yǎng)基上生長，并能分泌大量菊粉酶到培養(yǎng)基中，其細(xì)胞可作為單細(xì)胞蛋白的供體，其每升發(fā)酵液產(chǎn)生干細(xì)胞10.1g，粗蛋白含量53.0g/100g。眾所周知，酵母菌含有厚且硬的細(xì)胞壁，約有200nm的細(xì)胞膜。細(xì)胞壁外層主要成分β-1，3和β-1，6甘露聚糖，內(nèi)層為葡聚糖，間層有一層蛋白質(zhì)分子?？偟膩碚f，動物細(xì)胞不能合成相關(guān)的酶類去分解酵母菌細(xì)胞壁，在動物腸道內(nèi)很難直接利用酵母細(xì)胞，阻礙了大范圍的使用。在釀酒酵母、假絲酵母、曲霉、畢赤酵母中都發(fā)現(xiàn)自容突變株[12-13]，在敏感溫度下，這些酵母菌釋放包內(nèi)物質(zhì)到細(xì)胞外和培養(yǎng)基中。這些突變株的共性是：在非耐受溫度（通常37℃）下培養(yǎng)便喪失了生存能力。Zhang[13]研究獲得一株蛋白質(zhì)高產(chǎn)菌，命名Z114，經(jīng)37℃蒸餾水過夜處理，能夠釋放大量胞內(nèi)蛋白。

雪蓮果是多年生草本植物，其莖含有菊粉和多聚果糖[14-16]。用此植物作為營養(yǎng)物質(zhì)來培養(yǎng)Z114菌株。為了獲得合適的培養(yǎng)條件，通過單因子和正交試驗，確定合理的培養(yǎng)條件，并對釋放到胞外的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸組分分析，同時測定脂肪酸、核酸及維生素C的濃度，為一步利用海洋酵母單細(xì)胞蛋白質(zhì)打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酵母菌株 本試驗自行分離并保存的Cryptococcus aureus G7a[13]，Z114 為 G7a 突變株（每升發(fā)酵液能產(chǎn)生干細(xì)胞達(dá)到10.1 g，粗蛋白含量在53.0 g/100 g突變株），酵母菌保存在YPD培養(yǎng)基中，4℃保存。

1.1.2 主要溶液 pH 2.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；0.4 mol/L KOH－甲醇溶液：11.2 g KOH溶于500 mL無水甲醇中；14%BF3－甲醇溶液：30 mL BF3/乙醚加入到75 mL無水甲醇中。

1.1.3 儀器與設(shè)備日立835型高速氨基酸自動分析儀，安捷倫氣相色譜儀6890。

1.2 方法

1.2.1 雪蓮果處理 取100 g雪蓮果，去皮，用水蒸煮，100℃ 3 min，水解液過濾，適當(dāng)稀釋60.0，80.0，100.0，120.0，140.0，160.0，180.0和200.0 g/L，115℃滅菌，30 min。

1.2.2 豆餅粉水解液 取32g豆餅粉與250 mL水混合，加入0.25 mol/L鹽酸沸騰處理25 min，冷卻后用1.0 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5.5，稀釋到200 mL，終質(zhì)量濃度為160.0 g/L。

1.2.3 多因子正交試驗 為了考察各因素之間的相互作用，優(yōu)化適合Z114蛋白質(zhì)合成的發(fā)酵條件，根據(jù)已經(jīng)研究的結(jié)果，選擇了對單細(xì)胞蛋白影響較大的因素進(jìn)行試驗，通過L9（33）正交表進(jìn)行組合（表1），結(jié)果數(shù)據(jù)分析通過 Qualitek-4（2000）軟件分析[17]。

1.2.4 單細(xì)胞積累 取一環(huán)保存的菌株接種到液體培養(yǎng)基（YPD）中，培養(yǎng)24 h，到達(dá)所需濃度（OD600nm=30.0），取5 mL分別接種到45 mL的三角瓶（25.0 g/L豆餅粉，15.0 g/L硫酸銨，180.0 g/L雪蓮果浸出液）28℃，培養(yǎng)3 d。

表1 正交因素水平Table 1 L9（33）Orthogonal array design：factors and levels for orthogonal test

1.2.5 自溶突變株釋放蛋白質(zhì)的測定 將所選的自溶突變株接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24 h后，在4℃，5 000 g離心條件下收集發(fā)酵菌體，將菌液用0.9%的生理鹽水進(jìn)行離心洗滌，最后溶解在0.9%的滅菌生理鹽水中，使細(xì)胞的密度達(dá)到108個/mL。上述細(xì)胞懸浮液分別28℃和37℃培養(yǎng)過夜，第2天用考馬斯亮藍(lán)法測上清中放出蛋白質(zhì)的含量[13]。

1.2.6 細(xì)胞干重的測定 將酵母接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中28℃，170 r/min培養(yǎng)。取10 mL發(fā)酵液，在4℃、5 000 g條件下離心用生理鹽水洗滌并重復(fù)3次，每次離心10 min，獲得的細(xì)胞放于電熱恒溫干燥箱內(nèi)80℃干燥至離心管恒重[12]，然后將烘干的菌體用研缽研碎成粉取50 mg的烘干后的細(xì)胞在180℃消化1.5 h，通過凱氏定氮進(jìn)行蛋白質(zhì)的測定。

1.2.7 總糖和還原糖的測定 還原糖通過賽式方法測定，總糖水解成還原糖加以測定[7]。

1.2.8 氨基酸分析 將烘干至恒重菌粉取40 mg放于安瓿瓶中，吸取1 mL 6 mol/L于安瓿瓶中混勻。將安瓿瓶抽真空10 min立即用酒精噴燈封口。將安瓿瓶放置于烘箱中110℃下維持24 h。打開安瓿瓶進(jìn)行過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)移至燒杯或平皿中水浴干燥，加入1 mL蒸餾水再蒸干，如此反復(fù)兩次，最后加入1 mL pH 2.2檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液供儀器測定[18]。

必需氨基酸指數(shù)的測定方法：

公式中aai——樣品中某必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分?jǐn)?shù)；AAi——參比蛋白中該必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分?jǐn)?shù)。

1.2.9 脂肪酸含量的測定 將菌體烘干至恒重，去10g分別加入KOH－甲醇溶液、BF3－甲醇溶液二次混勻、在此加入正己烷，最后加入飽和NaCl溶液，通過氣相色譜儀上進(jìn)行GC分析[19-22]：注入溫度：170℃；注入初始時間：1 min；最后溫度230℃；監(jiān)測器溫度：260℃；載氣：N2。

1.2.10 核酸與維生素C的測定 DNA和RNA的測定參照Burton的方法，脫氧核糖核酸和核糖核酸分別通過二苯胺和地衣酚法測定[13]。

維生素從細(xì)胞中提取維生素C用Hancock方法測定[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度雪蓮果提取物對蛋白質(zhì)積累的影響

選擇不同濃度的雪蓮果提取物進(jìn)行試驗測定其對自溶突變株Z114蛋白質(zhì)合成的影響，分別選擇 60.0，80.0，100.0，120.0，140.0，160.0，180.0和200.0 g/L提取物加入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以蛋白質(zhì)含量為主要指標(biāo)，結(jié)果表明在160.0 g/L下如圖所示：細(xì)胞粗蛋白含量超過48.85%。

2.2 不同氮源對單細(xì)胞影響

為了測定不同氮源對自溶突變株Z114蛋白質(zhì)合成的影響，分別選了硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆餅粉為氮源，在4種氮源中，酵母粉（40.0 g/L），豆餅粉（35.0 g/L），蛋白胨（40.0 g/L）含量較高，表明這些氮源含有豐富的氨基酸，比較容易吸收和轉(zhuǎn)化為單細(xì)胞蛋白[12]。

圖1 不同雪蓮果提取物濃度對單細(xì)胞蛋白的影響Fig.1 Effects of different yacon extract concentrations on the mutant Z114 accumulation single cell protein

圖2 不同氮源對單細(xì)胞蛋白的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the mutant Z114 accumulation single cell protein

2.3 多因子試驗

根據(jù)單因子試驗結(jié)果，培養(yǎng)基中選擇了包括豆餅粉、硫酸銨、雪蓮果浸出液營養(yǎng)機(jī)制，進(jìn)行多因子正交L9（33）優(yōu)化試驗，其中選擇豆餅水解液和雪蓮果提取液作為氮源，這兩種氮源富含氨基酸與銨且來源于農(nóng)副產(chǎn)品，供應(yīng)充足，且兩種氮源價格相對低廉[12]。其它條件，溫度、pH值、裝樣量、轉(zhuǎn)速、 接種量分別：28℃、pH 自然、50 mL、170 r/min、10%（種子培養(yǎng)基中細(xì)胞濃度為 OD600nm=30.0 mL/100 mL），經(jīng)過3 d培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞分離與蛋白質(zhì)的測定結(jié)果如表2所示。

表2 結(jié)果分析Table 2 Design and results of orthogonal test

（續(xù)表2）

表3 方差分析Table 3 Analysis of the total protein of variance

多因素的結(jié)果分析如表2所示，主要因素依次是（A＞C＞B），最高單細(xì)胞濃度達(dá)到 54.3%，最佳組合是A2C3B2。并且培養(yǎng)基對蛋白自容無明顯影響。

方差分析表明水平間差異顯著（F＞F0.05=19.00），A（豆餅粉）、C（浸出液）兩因素對蛋白影響顯著。

2.4 細(xì)胞生長曲線和單細(xì)胞關(guān)系

在培養(yǎng)基優(yōu)化主要成分確定基礎(chǔ)上，測定了Z114細(xì)胞生長于單細(xì)胞蛋白積累隨時間變化曲線，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過培養(yǎng)45 h發(fā)酵，細(xì)胞中蛋白含量為59.1%。提取分離的細(xì)胞在蒸餾水中懸浮培養(yǎng)分別經(jīng)過28和37℃過夜處理，測定胞內(nèi)蛋白的釋放率，結(jié)果表明在37℃蛋白釋放達(dá)到61.84%，對照組28℃只有4.25%釋放率。

2.5 還原糖的變化

分別測定了發(fā)酵培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)基中總糖和還原糖濃度，以及發(fā)酵結(jié)束后培養(yǎng)基中殘留總糖和殘留還原糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G7a菌株總糖和還原糖的利用率分別為75.55%，81.69%，突變株Z114總糖和還原糖的利用率分別為71.11%和80.28%。還原糖的變化如表4所示，大部分糖都被利用。殘?zhí)呛枯^低，不會對環(huán)境造成污染。

圖3 細(xì)胞生長與蛋白生產(chǎn)曲線Fig.3 Time course of cell growth and single cell protein production

2.6 氨基酸分析

氨基酸組分分析表明G7a和自溶突變株利用雪蓮果提取物生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白都含有高濃度的必需氨基酸，尤其含有賴氨酸，蛋氨酸，亮氨酸，非必須氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸含量較高含量在（2.6%～13.68%），結(jié)果與本實驗室之前研究結(jié)果相似。菌株G7a和其自溶突變株氨基酸指數(shù)分別為1.03和1.29，表6也表明在酵母細(xì)胞中大部分必需氨基酸含量都高于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

表4 培養(yǎng)基中總糖和還原糖的變化Table 4 The change of total sugar and reducing sugar in the initial media and fermented media

表5 蛋白質(zhì)中氨基酸組分分析Table 5 Amino acid compositions of total amino acids of strain G7a and the mutant Z114

2.7 脂肪酸分析

以雪蓮果提取物為主要營養(yǎng)成分，測定了野生型和突變株在發(fā)酵生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白中脂肪酸的組成，結(jié)果表明無論在野生型和突變型中都含有少量的 C17：0脂肪酸，并含有大量的 C16：0，C18：0，C18：1，C18：2脂肪酸。

表6 野生型菌株與突變株細(xì)胞中脂肪酸分析Table 6 Fatty acid compositions（%of total fatty acids）of strain G7a and the mutant Z114

2.8 核酸與維生素C分析

核酸含量測定顯示突變株在雪蓮果提取物中發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白核酸含量在2%左右，可以作為飼料使用[24]，維生素C具有多種生理功能是很多生物生長所必需的，經(jīng)過雪蓮果提取物培養(yǎng)的突變株細(xì)胞維生素C含量如表7所示達(dá)到2.3 mg/100 g。

表7 G7a和Z114菌株細(xì)胞中核酸和維生素C濃度Table 7 Nucleic acids content and ascorbic acid content of G7a and Z114

3 討論

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)在160.0 g/L雪蓮果提取物時，每100 g恒重的干細(xì)胞可以獲得48.85 g粗蛋白，通過正交試驗最終確定發(fā)酵條件為溫度、pH值、裝樣量、轉(zhuǎn)速、接種量，分別為：28℃、pH自然、50 mL、170 r/min、10%，雪蓮果提取質(zhì)量濃度為180.0 g/L，豆餅粉水解液質(zhì)量濃度為25.0 g/L，硫酸銨質(zhì)量濃度為15.0 g/L，如表所示在此條件下培養(yǎng)45 h粗蛋白濃度59.1%，目前研究表明單細(xì)胞蛋白含量在39%～73%[22]，也說明自溶突變株為雪蓮果提取物為主要碳源積累單細(xì)胞蛋白達(dá)到較高的水平，經(jīng)過37℃過夜處理蛋白釋放達(dá)到61.84%，對照組28℃只有4.25%釋放率，也證明以雪蓮果提取為主要營養(yǎng)物質(zhì)并未影響突變株粗蛋白的釋放。

糖的利用率試驗表明，不論是野生型還是突變菌株都能夠充分利用雪蓮果提取物進(jìn)行細(xì)胞生長，同時用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。氨基酸組分分析表明自溶突變株利用雪蓮果提取物轉(zhuǎn)化合成了大量必需氨基酸，其中亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸含量比Brown等[11]的研究有一定提高。

研究結(jié)果表明：在雪蓮果提取物為氮源的培養(yǎng)過程中，核酸的含量很低，在2%左右，與之前研究結(jié)果相似[7，9，13]，文獻(xiàn)報道釀酒酵母核酸含量在7%～10%[23]，作為單細(xì)胞蛋白的成分之一，核酸對于水產(chǎn)動物[24]、家畜動物的腸道吸收都有一定促進(jìn)作用[25]。同時維生素C含量達(dá)到2.3 mg/100 g，說明突變株在雪蓮果提取物中生產(chǎn)的蛋白營養(yǎng)豐富。脂肪酸組分分析表明野生型和突變菌株都含有 大量的 C16：0，C18：0，C18：1，C18：2但是缺少兩種海洋生物所必需多不飽和脂肪酸（C20：5，C22：6），也說明海洋酵母菌不能合成這兩種脂肪酸。

眾所周知，雪蓮果莖中含有高濃度的菊粉，在研究中我們發(fā)現(xiàn)以自溶突變株為研究對象，雪蓮果浸出液可以作為培養(yǎng)基產(chǎn)生單細(xì)胞蛋白，在發(fā)酵結(jié)束時，總糖和還原糖含量都很低，表明突變株可以利用菊粉，在培養(yǎng)45 h后，粗蛋白和釋放蛋白分別為59.1%和61%，同時單細(xì)胞蛋白中還有動物必需氨基酸和其它營養(yǎng)成分，突變株細(xì)胞可以作為單細(xì)胞蛋白應(yīng)用到生產(chǎn)中。