微囊藻毒素的液-質(zhì)譜聯(lián)用和直接進(jìn)樣檢測(cè)方法比較

李詩言 崔益瑋 王 揚(yáng) 戴志遠(yuǎn) 沈 清 *

（1浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012

2浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心 杭州 310023

3浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310012）

微囊藻毒素（Microcystins）為藍(lán)藻水華釋放的一類具有強(qiáng)烈致癌作用的肝毒素，其毒性較大，分布廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體約80余種，其結(jié)構(gòu)由7個(gè)氨基酸組成，主要產(chǎn)自微囊藻（Microcystis aeruginosa）、魚腥藻（Anabaena）、念珠藻（Notoc）等浮游性藍(lán)藻，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中MC-LR最為常見[1]。調(diào)查表明，我國60%的水體由于過多接納了氮和磷等營養(yǎng)物質(zhì)，使水體的生態(tài)結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了重大變化，導(dǎo)致藻類的異常繁殖生長，從而出現(xiàn)藍(lán)藻水華現(xiàn)象[2]。水面湖靛堆積，大量消耗水中溶解氧致魚類窒息死亡，藻體死亡分解過程中釋放生物毒素類次級(jí)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致水體污染，水生動(dòng)植物死亡[3]。MC進(jìn)入人體肝細(xì)胞后，能強(qiáng)烈地抑制蛋白磷酸酶（PP1、PP2A）的活性，誘發(fā)細(xì)胞角蛋白高度磷酸化，導(dǎo)致肝細(xì)胞微絲分解、破裂和出血[4]。

食品中的微囊藻毒素的分析監(jiān)測(cè)對(duì)于維護(hù)食品安全和人類健康具有重要意義。微囊藻毒素被列為有機(jī)污染毒素的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，并有國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的水體中微囊藻毒素的安全質(zhì)量濃度為1 μg/L。目前主要化學(xué)分析法包括薄層色譜（TLC）[5]、氣相色譜（GC）[6]、液相色譜（LC）[7]、毛細(xì)管電泳（CE）[8]等。其中高效液相色譜法（HPLC）是目前應(yīng)用最多的方法，利用液相色譜的特點(diǎn)，與質(zhì)譜或核磁共振聯(lián)用確定其分子式和結(jié)構(gòu)[9]。該方法分析速度快，靈敏度高，結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確穩(wěn)定。該方法只針對(duì)目標(biāo)化合物，對(duì)于潛在的異構(gòu)體無法檢測(cè)。

本試驗(yàn)針對(duì)微囊藻毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有共同母核的結(jié)構(gòu)特征，創(chuàng)新性地采用PreIS的掃描方式，建立DIA檢測(cè)法，經(jīng)質(zhì)譜分析并優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，以提高離子化效率，降低雜質(zhì)干擾。通過比較LC-MS/MS和DIA兩種方法的線性、精密度、靈敏度、回收率、經(jīng)濟(jì)性等參數(shù)，建立穩(wěn)定、高效的微囊藻毒素分析方法，用于快速分析水體及動(dòng)植物中的殘留，確定監(jiān)測(cè)物種、采樣站位和頻率、警戒值和防控反應(yīng)機(jī)制等，為相關(guān)部門完善和強(qiáng)化水產(chǎn)品監(jiān)測(cè)和管理工作提供科學(xué)依據(jù)，從而保障食用安全和近岸養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

1200高效液相色譜系統(tǒng)，美國Agilent公司；4000QTrap串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國Ab Sciex公司，配有Harvard Pump11恒流注射泵、電噴霧離子源（ESI）及Analyst1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Sanorius BS110S分析天平，北京賽多利斯公司；MDF-382E超低溫冰箱，日本Sanyo公司；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2 主要材料與試劑

微囊藻毒素 MC-RR，YR，LR，LA，LF，LY 及LW標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95.0%）：臺(tái)灣 Algal Science公司，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1；Oasis HLB固相萃取柱，美國Waters公司；甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）和甲酸（FA），德國Merck公司，色譜純；純凈水，由Milli-Q超純水處理系統(tǒng)制得；其他試劑均為分析純；螺螄購買自杭州物美超市，新鮮度佳。

準(zhǔn)確稱取微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g，用甲醇溶解于10 mL棕色容量瓶并定容，分別配置成1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液至于4～6℃冷藏備用。

1.3 樣品處理

將10 g螺螄肌肉組織研磨均質(zhì)，取1 g置于5 mL離心管，加入5 mL萃取液（MeOH/water/FA，90/9.9/0.1，V/V）后振蕩混勻20 min，并用探頭式超聲（25 kHz，60%變幅）提取 10 min。完畢后混合物用冷凍離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）以8 000 r/min離心15 min。用移液槍轉(zhuǎn)移離心管中上清液到另一個(gè)新的移液管，并繼續(xù)向沉淀中加入5 mL萃取液并重復(fù)上述操作提取兩次。將3次提取的上清液合并，用氮?dú)獯蹈?，并用甲醇水溶液?fù)溶至約1 mL。

Oasis HLB固相萃取柱分別用6 mL甲醇和水活化。萃取液均勻上柱，并依次用6 mL純水和淋洗液（MeOH/water，5/95，V/V）淋洗，棄去淋洗液，以5 mL純甲醇洗脫吸附在HLB柱上的微囊藻毒素，流速控制在1滴/s左右，收集洗脫液。將洗脫液用氮?dú)饬鞔蹈?，使用初始流?dòng)相復(fù)溶至1 mL后過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液待儀器分析。

1.4 試驗(yàn)條件

1.4.1 LC-MS/MS條件 色譜柱：Waters XSelect HSS T3（2.1 mm × 150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫：ini，25%B；0～1 min，25%B；1～5 min，25%～95%B；5～9 min，95%B；9～10，95%～25%B；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)離子檢測(cè)模式（MRM），噴霧電壓5.5 kV，干燥溫度450℃，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離氣為氮?dú)?，氣簾?0 psi，GS1 為 35 psi，GS2 為 55 psi。

1.4.2 直接進(jìn)樣條件 注射泵進(jìn)樣流速20 μL/min；質(zhì)量掃描范圍m/z 400～600。電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，PreIS 離子檢測(cè)模式，特征碎片離子為m/z 135.2，噴霧電壓5.5 kV，干燥溫度550℃，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離氣為氮?dú)狻?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 微囊藻毒素離子化特征分析

微囊藻毒素的離子化特征是影響分析結(jié)果的重要因素之一。試驗(yàn)首先通過注射進(jìn)樣1 ng/mL的各微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Q1全掃描。微囊藻毒素在正離子模式的離子化效率顯著優(yōu)于負(fù)離子模式，各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的雙電荷和單電荷離子峰均有檢出，如質(zhì)子化、鈉離子化、鉀離子化及組合離子化（[M+H+Na]2+）等。鑒于實(shí)際樣品檢測(cè)過程中復(fù)雜基質(zhì)干擾易造成雙電荷和單電荷離子峰強(qiáng)度比例波動(dòng)，進(jìn)而影響定量結(jié)果，需優(yōu)化檢測(cè)條件，盡可能使微囊藻毒素離子結(jié)構(gòu)單一化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)向溶劑中添加0.1%的甲酸可顯著提高微囊藻毒素雙電荷離子強(qiáng)度，抑制單電荷離子強(qiáng)度（圖2）。因此，本試驗(yàn)7種微囊藻毒素均采用[M+2H]2+為MRM模式的母離子。該試驗(yàn)結(jié)果與部分報(bào)道有所不同，Beltrán檢測(cè)了6種微囊藻毒素發(fā)現(xiàn)除了MC-RR易形成雙電荷[M+2H]2+外，其余均檢測(cè)為[M+H]+[10]；王超等[11]建立了反復(fù)凍融-固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定藍(lán)藻中5種微囊藻毒素的方法，選用MC-RR、MC-YR和MC-LR的[M+2H]2+為母離子，其余為[M+H]+。本試驗(yàn)進(jìn)一步通過安捷倫6540 QToF離子化驗(yàn)證，初步認(rèn)定不同廠家的質(zhì)譜儀均會(huì)對(duì)微囊藻毒素離子化行為造成顯著影響。由于微囊藻毒素離子化行為的特殊性，建議針對(duì)不同質(zhì)譜儀建立相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法。

圖1 微囊藻毒素骨架結(jié)構(gòu)圖與微囊藻毒素R1和R2位置官能團(tuán)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The chemical structures of microcystin backbone and the groups of R1and R2

2.2 直接進(jìn)樣條件優(yōu)化

直接進(jìn)樣法是一種基于三重四極桿質(zhì)譜儀，利用特征官能團(tuán)，通過離子源內(nèi)分離實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品中目標(biāo)化合物快速掃描的方法。該方法主要利用母離子掃描模式，選定目標(biāo)化合物經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的共有母核，同步檢測(cè)對(duì)應(yīng)母離子及含相同母核的同系物。目前直接進(jìn)樣法應(yīng)用于磷酸化多肽[12]、天然產(chǎn)物[13]、脂質(zhì)組學(xué)[14-15]等研究。本試驗(yàn)通過注射進(jìn)樣1 ng/mL的各微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行子離子掃描檢測(cè)，微囊藻毒素裂解產(chǎn)生的碎片較多，典型碎片包括m/z 213.2、m/z 163.0、m/z135.2、m/z 105.2、m/z 103.1 等（表1），其中 m/z 135.2為微囊藻毒素的共有基團(tuán)Adda的甲氧鍵斷裂形成的特征碎片峰，該峰豐度最強(qiáng)，故設(shè)定m/z135.2為特征子離子掃描含有該母核的目標(biāo)化合物。由于母離子掃描模式下無法針對(duì)各個(gè)微囊藻毒素單獨(dú)設(shè)置DP和CE，通過折衷優(yōu)化選定DP 60 eV和CE 55 eV。直接進(jìn)樣法母離子掃描模式下7種微囊藻毒素質(zhì)譜圖見圖3，各微囊藻毒素的離子峰較為純凈，均主要以[M+2H]2+為主，鈉離子化和鉀離子化峰不明顯。

2.3 LC-MS/MS條件優(yōu)化

向流動(dòng)相A、B中分別加入0.1%的甲酸，使微囊藻毒素的液相環(huán)境與針泵優(yōu)化時(shí)條件一致，最大化雙電荷離子化微囊藻毒素質(zhì)譜峰豐度。采用流動(dòng)注射的方式優(yōu)化得到最佳質(zhì)譜參數(shù)噴霧電壓5.5 kV，干燥溫度 450℃，源內(nèi)氣簾氣 30 psi，GS1為35 psi，GS2為55 psi，并對(duì)不同微囊藻毒素優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞電壓（CE）結(jié)果見表1。

圖2 甲酸酸化微囊藻毒素全掃描模式下質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrogram of microcystins under Q1 full scan with formic acid

圖3 直接進(jìn)樣法母離子掃描模式下檢測(cè)7種微囊藻毒素Fig.3 PreIS of seven microcystins by direct injection method

表1 微囊藻毒素質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The parameters of mass spectrometry for microcystins

使用梯度洗脫7種微囊藻毒素并在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，峰型尖銳、對(duì)稱（圖4），出峰順序?yàn)?MC-RR、YR、LR、LA、LY、LW 及 LF，對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間分別 為 6.52，6.93，7.01，8.20，8.25，8.74及9.01 min。含精氨酸（R）片段的微囊藻毒素（MC-RR、YR和LR）極性較強(qiáng)，尤其MC-RR含有兩個(gè)精氨酸片段，故首先出峰，MC-LW和LF的保留時(shí)間較長，主要由于其側(cè)鏈苯環(huán)增加了與C18固定相之間的疏水作用，進(jìn)而提高了其在色譜柱上的保留能力。

2.4 方法比較

逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合工作液分別進(jìn)行LC-MS/MS和DIA檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件分析計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線線性，以S/N=3所對(duì)應(yīng)的被測(cè)化合物的含量作方法的檢出限（LOD），以S/N=10所對(duì)應(yīng)的被測(cè)化合物的含量作方法的定量下限（LOQ）；于空白螺螄樣品中分別加入10 μg/L含量的微囊藻毒素標(biāo)樣，每組做6個(gè)平行樣品，分析并測(cè)定精密度及回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。使用LC-MS/MS建立的微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（0.9965～0.9993）優(yōu)于DIA標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.9907～0.9968）。由于微囊藻毒素在針泵進(jìn)樣時(shí)樣品未經(jīng)預(yù)分離直接源內(nèi)離子化，離子化競爭較為激烈，導(dǎo)致單個(gè)微囊藻毒素離子化效率降低，而LC-MS/MS中混合樣品經(jīng)色譜預(yù)分離，源內(nèi)單個(gè)微囊藻毒素較為純凈，因此DIA的LOD和LOQ均高于LC-MS/MS。LC-MS/MS微囊藻毒素回收率范圍在73.9%～83.4%（RSD 3.6%～6.1%），而DIA的回收率在69.3%～84.2%（7.6%～9.8%）。相比之下，DIA分析時(shí)間較短，同時(shí)檢測(cè)7種微囊藻毒素僅需1 min即可完成，而LC-MS/MS需要10 min才能檢測(cè)完成。除此之外，DIA無需液相色譜柱和流動(dòng)相溶劑，可大大縮減耗材成本、減輕環(huán)境負(fù)擔(dān)。

圖4 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下7種微囊藻毒素的提取離子流圖Fig.4 The extracted ion chromatography of seven microcystins under MRM mode

2.5 實(shí)際樣品分析

螺螄樣品采自本地農(nóng)貿(mào)市場，兩種檢測(cè)方法均從60個(gè)隨機(jī)樣品中檢出陽性樣品38個(gè)。結(jié)果顯示主要微囊藻毒素污染種類為MC-RR和LR，MC-YR、LA、LF、LY 及 LW 均未檢出；以螺螄為代表的淡水生物微囊藻毒素污染較為嚴(yán)重，陽性率達(dá)到了63.3%，間接反映河道水體富營養(yǎng)化污染，藻類大量繁殖，釋放毒素并通過食物鏈生物富集對(duì)人類健康造成威脅。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)分別采用了LC-MS/MS和DIA對(duì)7種微囊藻毒素進(jìn)行了分析檢測(cè)。LC-MS/MS是目前最為廣泛使用的化合物定量方法，通過甲酸酸化溶劑抑制單電荷離子強(qiáng)度，選用雙電荷離子為MRM定量定性母離子大大提高了方法穩(wěn)定性。DIA為新型快速檢測(cè)技術(shù)，選定碎片m/z 135.2可快速篩查所有含有該母核的微囊藻毒素，該方法目前尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。通過比較發(fā)現(xiàn)兩種方法在精確度、靈敏度、回收率、耗時(shí)等方面各有優(yōu)缺點(diǎn)。根據(jù)研究結(jié)果建議當(dāng)待測(cè)樣品數(shù)量較多時(shí)，首先采用DIA進(jìn)行初次篩選，對(duì)于陽性樣品利用LC-MS/MS進(jìn)行二次檢測(cè)。該分析測(cè)試策略可有效減少檢測(cè)時(shí)間、色譜柱損耗及溶劑消耗，提高效率、降低成本；同時(shí)陽性樣品先后經(jīng)DIA和LC-MS/MS檢測(cè)相當(dāng)于對(duì)結(jié)果進(jìn)行了二次驗(yàn)證，提高了結(jié)果的可靠性。

表2 微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和直接進(jìn)樣法效率比較Table 2 The performance comparison of LC-MS/MS and direct injection methods for the analysis of microcystins