運(yùn)動(dòng)對(duì)睡眠剝奪引起胰島素抵抗和T2DM風(fēng)險(xiǎn)升高的緩解作用初探

齊一凡 王昊然 萬(wàn)莉紅

(1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)2015級(jí)基地班；2. 華西臨床醫(yī)學(xué)院2016級(jí)；3. 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041)

睡眠缺乏是現(xiàn)代社會(huì)中常見(jiàn)的問(wèn)題，與一系列慢性健康問(wèn)題相關(guān)，特別是2型糖尿病胰島素抵抗(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)。研究表明，連續(xù)6天每日4小時(shí)睡眠，甚至一天睡眠時(shí)間不足4小時(shí)都會(huì)導(dǎo)致胰島素敏感性降低[1,2]。流行病學(xué)研究的證據(jù)也支持睡眠不足會(huì)誘發(fā)葡萄糖耐受異常和胰島素抵抗[3]。生物鐘節(jié)律失調(diào)和骨骼肌線(xiàn)粒體功能受損可能是睡眠導(dǎo)致胰島素抵抗的原因[4]。運(yùn)動(dòng)影響時(shí)鐘基因表達(dá)，可能會(huì)降低睡眠不足帶來(lái)的負(fù)面影[5]。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建睡眠剝奪-胰島素抵抗小鼠模型，探究運(yùn)動(dòng)對(duì)于睡眠不足引起胰島素抵抗的緩解作用，為睡眠不足引發(fā)的T2DM提供新的干預(yù)思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物

32只3周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雌雄各半，體重10±2 g，批號(hào)：SCXK(渝)2018-0003，購(gòu)自重慶恩斯維爾科技有限公司。所有小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠8只。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度23±1℃，相對(duì)濕度50%±5%，自由飲食水，光暗周期為12/12 h(6∶00am開(kāi)燈，6∶00pm關(guān)燈)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 w。

1.1.2儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)室自制改良多平臺(tái)睡眠剝奪裝置：標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)塑料籠(長(zhǎng)37.5 cm×寬32.0 cm×高16.0 cm)，內(nèi)固定14根供小鼠站立的小木塊(長(zhǎng)2.0 cm×寬2.0 cm×高5.0 cm)；小鼠血糖測(cè)量?jī)x(北京怡成生物電子技術(shù)股份有限公司)；小鼠胰島素試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：E-EL-M2614c)；葡萄糖溶液；嚙齒類(lèi)動(dòng)物固定器。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組

32只小鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)至6周齡，體重15 g～25 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為：對(duì)照組、睡眠剝奪組、運(yùn)動(dòng)A組、運(yùn)動(dòng)B組，每組8只，雌雄各半。除對(duì)照組外，其余各組小鼠建立睡眠剝奪模型；運(yùn)動(dòng)A，B組小鼠在此基礎(chǔ)上采用不同運(yùn)動(dòng)模式進(jìn)行干預(yù)，具體如下：運(yùn)動(dòng)A組小鼠進(jìn)行不間歇的長(zhǎng)時(shí)間游泳訓(xùn)練30 min；運(yùn)動(dòng)B組小鼠進(jìn)行間歇游泳訓(xùn)練，每游泳10 min休息10 min，重復(fù)3個(gè)循環(huán)，總游泳時(shí)長(zhǎng)為30 min。

1.2.2睡眠剝奪-胰島素抵抗模型

利用小鼠不能站立入睡的生理特征，采用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法(Modified multiple platform，MMPM)對(duì)小鼠進(jìn)行睡眠剝奪[6]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)采取睡眠剝奪16 h·d-1，連續(xù)4 d的方案，使小鼠在高存活率下表現(xiàn)出胰島素抵抗。

具體方法：向改良多平臺(tái)睡眠剝奪裝置中注入水，水深為4 cm。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天6:00 am將小鼠放入平臺(tái)睡眠剝奪裝置，每個(gè)裝置8只小鼠，小鼠在裝置中活動(dòng)不受限制，自由飲食和飲水。16 h后(即10:00 pm)將小鼠從剝奪裝置中取出，用吸水紙輕柔擦干小鼠全身，吹風(fēng)機(jī)吹干后放入鼠籠，給予充足的食物和水，恢復(fù)8 h后進(jìn)入第二天睡眠剝奪階段，持續(xù)4 d。

1.2.3運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練

采用水深8 cm睡眠剝奪水箱，使小鼠在25 ℃深水中強(qiáng)迫游泳，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)一般可被分為4個(gè)狀態(tài)，即游泳、攀爬、漂浮、下沉狀態(tài)。為達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，采用輕柔刺激法使小鼠保持在游泳狀態(tài)。

1.2.4口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(Oral glucose tolerance test，OGTT試驗(yàn))

所有小鼠禁食不禁水12 h后立即自尾靜脈取血測(cè)量0 min血糖。并灌胃給予小鼠20%葡萄糖溶液2 g·kg-1，在給予葡萄糖后30 min、60 min、90 min、120 min分別測(cè)量各時(shí)刻血糖值，記錄數(shù)據(jù)，繪制OGTT曲線(xiàn)。

1.2.5胰島素測(cè)定

準(zhǔn)備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%乙二胺四乙酸鈉鹽(EDTA)溶液，按照每毫升血液1.2 mg EDTA，提前加入樣品管中。小鼠禁食不禁水12 h后立即自尾靜脈取血40 μL，1000×g離心15 min，取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血漿胰島素濃度，按照小鼠胰島素試劑盒步驟進(jìn)行操作。

1.2.6HOMA-IR評(píng)估

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需要根據(jù)所有小鼠空腹時(shí)血糖和胰島素值計(jì)算HOMA公式中的校正系數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)前的穩(wěn)態(tài)平均水平計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)公式為：HOMA-IR=禁食血糖(mmol·L-1)×禁食胰島素(mU·L-1)/0.58。實(shí)驗(yàn)后將每組小鼠OGTT試驗(yàn)0 min時(shí)血樣數(shù)據(jù)帶入公式計(jì)算，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析判斷胰島素抵抗是否產(chǎn)生組間差異。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OGTT試驗(yàn)結(jié)果

OGTT試驗(yàn)糖耐曲線(xiàn)趨勢(shì)：運(yùn)動(dòng)A組與對(duì)照組曲線(xiàn)下降趨勢(shì)相似，運(yùn)動(dòng)B組有下降趨勢(shì)但血糖值高于對(duì)照組，睡眠剝奪組短暫下降后進(jìn)入平臺(tái)期；OGTT試驗(yàn)30 min時(shí)血糖：睡眠剝奪組和運(yùn)動(dòng)B組小鼠空腹血糖明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)A組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)；OGTT試驗(yàn)60 min時(shí)血糖：睡眠剝奪組和運(yùn)動(dòng)B組的血糖明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)A組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P=0.43)；OGTT試驗(yàn)90 min時(shí)血糖：睡眠剝奪組和運(yùn)動(dòng)B組的血糖明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)A組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)；睡眠剝奪組和B運(yùn)動(dòng)組出現(xiàn)糖耐量異常，見(jiàn)圖1。

圖1 OGTT糖耐曲線(xiàn)量曲線(xiàn)注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與睡眠剝奪組相比，#P<0.05。

2.2 HOMA-IR模型評(píng)估結(jié)果

通過(guò)將禁食12h后每只小鼠血液樣本中血糖值和胰島素含量帶入公式計(jì)算，可得每只小鼠的胰島素抵抗指數(shù)(IR)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：睡眠剝奪組的胰島素抵抗組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；在睡眠剝奪基礎(chǔ)上進(jìn)行不間歇長(zhǎng)時(shí)間游泳訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)A組小鼠，胰島素抵抗水平明顯低于睡眠剝奪組(P<0.05)，與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯區(qū)別(P>0.05)；在睡眠剝奪基礎(chǔ)上進(jìn)行間歇游泳訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)B組小鼠，胰島素抵抗水平與睡眠剝奪組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 HOMA-IR評(píng)估胰島素抵抗注：與睡眠剝奪組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)能夠緩解小鼠睡眠缺乏導(dǎo)致的胰島素抵抗，實(shí)驗(yàn)要求小鼠睡眠剝奪模型與小鼠運(yùn)動(dòng)模型相結(jié)合。由于睡眠缺乏和運(yùn)動(dòng)為本實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)控制變量，為了避免小鼠睡眠剝奪過(guò)程中產(chǎn)生大量運(yùn)動(dòng)，干擾運(yùn)動(dòng)模型，本實(shí)驗(yàn)采用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法[6]替代常用的旋轉(zhuǎn)圓筒睡眠剝奪法，達(dá)到控制變量的目的。

HOMA-IR模型是1985年由Matthews等人提出的一種穩(wěn)態(tài)模型，通過(guò)測(cè)量禁食后的血糖和胰島素含量評(píng)估胰島素抵抗程度。在評(píng)估胰島素敏感性的方法中，正常血糖高胰島素鉗夾技術(shù)是測(cè)量胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該技術(shù)需要多次取血，因此應(yīng)用于小鼠實(shí)驗(yàn)不僅對(duì)小鼠本身產(chǎn)生較大負(fù)擔(dān)而且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高，并不適用。而采用HOMA-IR模型評(píng)估胰島素敏感性，試驗(yàn)過(guò)程中僅需取空腹血液1次，能充分保證小鼠存活，且重復(fù)性高，與正常血糖高胰島素鉗夾技術(shù)相比有很高的相關(guān)性[7,8]，故本實(shí)驗(yàn)采取HOMA-IR模型評(píng)估小鼠胰島素水平。人群計(jì)算公式為：HOMA-IR=禁食血糖(mmol·L-1)×禁食胰島素(mU·L-1)/22.5，系數(shù)22.5為正常理想人群條件下的校正因子。由于HOMA模型開(kāi)發(fā)基于正常人群的穩(wěn)態(tài)，不能簡(jiǎn)單套用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)根據(jù)此次所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前的穩(wěn)態(tài)計(jì)算公式中的校正系數(shù)。

睡眠缺乏是2型糖尿病胰島素抵抗發(fā)展的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，而運(yùn)動(dòng)可能會(huì)減輕睡眠缺乏的影響。本次實(shí)驗(yàn)證明了長(zhǎng)時(shí)間不間斷運(yùn)動(dòng)可以作為睡眠不足引起的胰島素抵抗和二型糖尿病的早期干預(yù)手段，對(duì)于改善胰島素抵抗的效果比同樣時(shí)間長(zhǎng)度的間斷運(yùn)動(dòng)更好。本次實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)兩種運(yùn)動(dòng)，A，B運(yùn)動(dòng)的總時(shí)間相同，但是B運(yùn)動(dòng)相較于A(yíng)運(yùn)動(dòng)存在間隔。對(duì)于相同時(shí)間的連續(xù)運(yùn)動(dòng)和間隔運(yùn)動(dòng)之間的區(qū)別已有研究進(jìn)行探索。12周的每天30min運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與3次10min間隔運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練相比，在最大攝氧量和血膽固醇構(gòu)成上沒(méi)有明顯區(qū)別[9]。另一項(xiàng)對(duì)于小鼠的研究表明，30min的連續(xù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和10min的3次間隔訓(xùn)練在改變線(xiàn)粒體代謝的信號(hào)通路上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的不同，通過(guò)對(duì)于線(xiàn)粒體代謝p38 MAPK通路的研究表明兩種運(yùn)動(dòng)都可以提高線(xiàn)粒體代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。運(yùn)動(dòng)緩解睡眠缺乏導(dǎo)致胰島素抵抗可能是通過(guò)改善生物節(jié)律和線(xiàn)粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)于連續(xù)運(yùn)動(dòng)和間隔運(yùn)動(dòng)影響睡眠缺乏后的生物節(jié)律和線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)導(dǎo)還沒(méi)有相關(guān)研究，其具體機(jī)制以及不同運(yùn)動(dòng)模式間存在的區(qū)別將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探索。