伴病理性乳頭溢液的乳腺癌患者癌組織整合素β1的表達(dá)及意義

孫全武，杜小平*，郝 杰，時(shí) 榮，劉 波，黃海云

(甘肅省人民醫(yī)院乳腺外科，甘肅 蘭州 730000)

乳頭溢液是女性患者在乳腺科門(mén)診常見(jiàn)就診原因之一[1]。雖然導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤是病理性乳頭溢液(pathological nipple discharge，PND)的最常見(jiàn)病因，但既往研究發(fā)現(xiàn)，2.8%～21.3%的女性乳頭溢液患者最終被診斷為乳腺癌[2]，因?yàn)楫?dāng)乳腺癌侵犯大導(dǎo)管引起乳管內(nèi)出血性或?qū)Ч軆?nèi)乳頭狀癌刺激乳管分泌增加，可出現(xiàn)病理性乳頭溢液。一項(xiàng)meta分析納入3 110名乳頭溢液患者，結(jié)果乳腺癌的發(fā)病率占18.7%[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)整合素β1高表達(dá)與浸潤(rùn)性微乳頭狀癌的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。我們前期通過(guò)meta分析發(fā)現(xiàn)整合素β1高表達(dá)與乳腺癌總生存期低顯著相關(guān)[5]， 合 并 風(fēng) 險(xiǎn) 比 HR=1.88， 95%CI(1.46， 2.42)(P＜0.01)；整合素β1高表達(dá)與乳腺癌無(wú)病生存期降低顯著相關(guān)，合并HR=1.63，95%CI(1.17，2.25)(P＜0.01)。目前，以病理性乳頭溢液為首發(fā)癥狀的乳腺癌患者病理特征研究較少，本研究采用免疫組化檢測(cè)乳腺癌伴病理性乳頭溢液患者癌組織中整合素β1的表達(dá)，并選取同期以乳房腫塊或體檢發(fā)現(xiàn)異常而就診的乳腺癌病例作為對(duì)照，分析整合素β1與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，探討其對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

自甘肅省人民醫(yī)院病案管理系統(tǒng)調(diào)閱2006年1月1日—2013年12月31日期間在乳腺外科行手術(shù)治療的乳腺癌病例資料。檢索這些患者的臨床資料，包括初診時(shí)年齡、絕經(jīng)狀況、腫瘤大小、是否轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)、術(shù)后病檢及免疫組化結(jié)果、術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡時(shí)間。排除隨訪資料不完整、后續(xù)在其他醫(yī)院復(fù)查以及Her-2檢測(cè)不確定的患者。以該院收治的112例伴乳頭溢液就診的乳腺癌作為研究對(duì)象(PND組)，部分患者查體或影像學(xué)檢查可伴有乳房腫塊。選取同期以乳房腫塊或體檢發(fā)現(xiàn)異常而就診的112例乳腺癌作為對(duì)照組，這部分患者在發(fā)病過(guò)程以及體格檢查均未見(jiàn)乳頭溢液。在該院病理科調(diào)取以上患者標(biāo)本，所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定及石蠟包埋，采用免疫組化檢測(cè)乳腺癌組織中整合素β1的表達(dá)。

1.2 方法

1.2.1 病理及免疫組化檢測(cè)方法 分析以下臨床因素和病理組織學(xué)指標(biāo)：年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)和雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)狀態(tài)、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Her-2)狀態(tài)等。ER、PR、Ki-67、Her-2為術(shù)后常規(guī)檢測(cè)，數(shù)據(jù)記錄在病案數(shù)據(jù)庫(kù)。ER和PR免疫組化檢測(cè)結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[6]，Her-2/neu蛋白(+++)陽(yáng)性表達(dá)者直接確定為陽(yáng)性，(++)陽(yáng)性表達(dá)者進(jìn)一步行多重?zé)晒庠浑s交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)，根據(jù)基因擴(kuò)增結(jié)果確定為陽(yáng)性或陰性，具體判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]，對(duì)于個(gè)別Her-2的FISH檢測(cè)結(jié)果不確定者送其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步核實(shí)，確保Her-2檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。免疫組化用切片厚4μm，抗體為小鼠抗人整合素β1(1∶100稀釋)單克隆抗體(4B7R)，美國(guó)圣克魯斯生物科技公司產(chǎn)品。根據(jù)常規(guī)親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法(avidin biotin-peroxidase comples，ABC)使用DAKO全自動(dòng)免疫組化儀染色。免疫組化結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[8]，根據(jù)染色強(qiáng)度(無(wú)色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分)，腫瘤細(xì)胞膜或核陽(yáng)性染色百分比(＜10%計(jì) 0分、≥10%～25%計(jì) 1分、≥25%～50%計(jì)2分、≥50%計(jì)3分)，染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積≤4分確定為陰性(-)，≥6分確定為陽(yáng)性(+)。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism 7.0軟件繪制生存曲線；其余統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0軟件，率的比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)，Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析單因素及多因素對(duì)伴乳頭溢液組患者總生存期的影響，Kendall’s tau-b檢驗(yàn)分析伴乳頭溢液組整合素β1表達(dá)與Her-2的相關(guān)性；卡方檢驗(yàn)分析伴乳頭溢液組整合素β1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般資料的對(duì)比

伴病理性乳頭溢液組與對(duì)照組患者在年齡構(gòu)成、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面基線值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)，說(shuō)明兩組患者間具有可比性。

表1 伴病理性乳頭溢液組與對(duì)照組患者資料及病理學(xué)特征基線值對(duì)比(n=112)

2.2 伴乳頭溢液組整合素β1的陽(yáng)性表達(dá)

癌組織整合素β1免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖1。伴乳頭溢液組整合素β1陽(yáng)性表達(dá)率為14.29%(16/112)，顯著低于對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率25%(28/112)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.073，P=0.044)；伴乳頭溢液組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)整合素β1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移者(P均＜0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 乳腺癌組織整合素β1免疫組化結(jié)果(×200)

表2 整合素β1在伴乳頭溢液組癌組織中的表達(dá)情況

2.3 整合素β1表達(dá)對(duì)乳腺癌預(yù)后的影響

Kaplan Meier法生存分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組總生存期明顯低于伴乳頭溢液組(HR=1.773，P=0.012)，伴乳頭溢液組整合素β1高表達(dá)患者的總生存期明顯低于低表達(dá)組(HR=2.573，P=0.023)，見(jiàn)圖2。進(jìn)一步采用Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析單變量和多變量對(duì)伴乳頭溢液組患者總生存期的影響。結(jié)果顯示乳頭溢液組整合素β1的表達(dá)與Her-2呈正相關(guān)(r=0.281，P=0.001)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)以及整合素β1高表達(dá)是影響伴乳頭溢液組乳腺癌患者總生存期的3個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均＜0.01)，見(jiàn)表3和表4。

圖2 乳腺癌患者生存曲線圖

3 討論

整合素β1作為黏附分子與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān)，最近研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素-1與整合素β1的結(jié)合通過(guò)促進(jìn)生存素在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)而增強(qiáng)了耐藥性[9]。整合素β1與Her-2共享部分信號(hào)通路下游分子，如磷脂酰肌醇3-激酶/Akt和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)通路[10]。Lesniak 等[11]采用小干擾 RNA基因敲低整合素β1的表達(dá)，證明整合素β1高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖是通過(guò)活化PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路活性而起作用。而曲妥珠單抗是通過(guò)拮抗Her-2/PI3K/Akt信號(hào)活性抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外，整合素介導(dǎo)的生長(zhǎng)因子受體活化可能進(jìn)一步觸發(fā)其他生存信號(hào)機(jī)制，并抵消曲妥珠單抗的抗腫瘤作用[11]，所以整合素β1高表達(dá)會(huì)降低曲妥珠單抗對(duì)Her-2陽(yáng)性乳腺癌的療效。而且整合素β1通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用活化PI3K/Akt信號(hào)通路，保護(hù)乳腺癌細(xì)胞免受化療[12]或電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13]，所以整合素β1表達(dá)不但降低曲妥珠單抗的抗腫瘤作用，而且影響腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，顯著影響乳腺癌的預(yù)后。

表3 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析單變量對(duì)乳頭溢液組患者總生存期的影響

表4 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析多變量對(duì)乳頭溢液組患者總生存期的影響

已有研究[14]證明，整合素可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲。整合素β1是整合素家族最廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的生物標(biāo)記物，可預(yù)測(cè)腫瘤患者的臨床過(guò)程和預(yù)后[15]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示伴乳頭溢液組整合素β1陽(yáng)性表達(dá)率為14.29%(16/112)，顯著低于對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率25%(28/112)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.073，P=0.044)；伴乳頭溢液組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)整合素β1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移者(P均＜0.05)；且乳頭溢液組患者整合素β1高表達(dá)者總生存期顯著降低，提示整合素β1表達(dá)水平越高預(yù)后越差。這與整合素β1陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等預(yù)后不良密切相關(guān)的結(jié)論相符合[15]。早期納入研究的部分患者因交通條件受限以及術(shù)后不按時(shí)復(fù)查，無(wú)病生存期數(shù)據(jù)有偏差，所以，未分析整合素β1高表達(dá)對(duì)乳頭溢液組患者無(wú)病生存期的影響。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可以通過(guò)上調(diào)和(或)活化整合素β1促進(jìn)血管形成，進(jìn)一步采用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，阻斷整合素β1表達(dá)后所有血管生成過(guò)程均受到抑制(包括黏連、遷移、毛細(xì)血管形態(tài)發(fā)生)，因此，他們提出整合素α6β1與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至大腦密切相關(guān)。針對(duì)整合素β1的靶向治療或許能延緩乳腺癌腦轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)乳腺癌患者總生存期和無(wú)病生存期。近來(lái)，國(guó)外學(xué)者曾針對(duì)Her-3和整合素β1聯(lián)合靶向治療Her-2陽(yáng)性乳腺癌，發(fā)現(xiàn)是一種非常有效的治療措施，且證實(shí)了Her-3也是介導(dǎo)Her-2陽(yáng)性乳腺癌進(jìn)展的主要因素[17]。今后采用抗Her-2、Her-3以及整合素β1的多靶點(diǎn)治療或許成為Her-2陽(yáng)性乳腺癌的治療方向。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)整合素β1在伴乳頭溢液組的癌組織高表達(dá)可顯著降低乳腺癌患者總生存期，可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，整合素β1有望成為判定乳腺癌預(yù)后的新指標(biāo)。與其他首發(fā)癥狀為主的患者相比，以乳頭溢液為首發(fā)癥狀的乳腺癌預(yù)后相對(duì)較好，如果及時(shí)篩查、早發(fā)現(xiàn)、早診治，將會(huì)顯著提高其治愈率。本次研究的局限性在于納入Her-2陽(yáng)性乳腺癌例數(shù)較少、可能導(dǎo)致研究結(jié)果偏倚，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)其對(duì)伴乳頭溢液組患者總生存期無(wú)明顯影響。以及出院后的治療依存性等都會(huì)影響本次研究結(jié)果，所以研究結(jié)論尚需多中心大量本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。今后更嚴(yán)格地選擇對(duì)曲妥珠單抗治療敏感的患者，盡量減少不必要的藥物毒性，如心臟事件[18]，避免因整合素β1過(guò)表達(dá)引起曲妥珠單抗治療無(wú)效或療效不佳。對(duì)于整合素β1過(guò)表達(dá)的乳腺癌患者，探索新的替代治療策略，如研制針對(duì)整合素β1的小分子或抗體抑制劑或許能進(jìn)一步提高療效、延長(zhǎng)總生存期。