• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-95與胃癌細(xì)胞洛鉑敏感性的關(guān)系及作用機制研究

    2019-10-10 06:08:10檀碧波范立僑爾麗綿
    癌變·畸變·突變 2019年5期
    關(guān)鍵詞:敏感性陰性耐藥

    溫 轉(zhuǎn),檀碧波,李 勇,*,趙 群,范立僑,王 冬,爾麗綿

    (1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院質(zhì)量控制辦公室,河北 石家莊 050011;2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科,河北 石家莊 050011;3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)鏡室,河北 石家莊 050011)

    胃癌在我國的發(fā)病率與死亡率高居第2位,僅次于肺癌,并且進展期胃癌占大多數(shù)[1]?;熢谖覈赴┑木C合治療中占有重要地位,但多藥耐藥性(multidrug resistance)常影響化療效果[2-3]。microRNA(miR)通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄后的水平,參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與耐藥[4-6]。有報道,miR-95為microRNA家族中的一員,參與乳腺癌、前列腺癌的抗輻射性及肺癌對放化療的耐藥[5,7]。但關(guān)于miR-95在胃癌中的表達及其與胃癌細(xì)胞耐藥性的關(guān)系尚不明確。本研究應(yīng)用qPCR法檢測miR-95在胃癌組織中的表達,并應(yīng)用miR-95抑制物(anti-miR-95)和miR-95模擬物(miR-95 mimics)分別轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC7901,檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞經(jīng)洛鉑(lobaplatin,LBP)處理后細(xì)胞活性的變化,探討miR-95與胃癌細(xì)胞對洛鉑敏感性的關(guān)系及作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 組織標(biāo)本

    選取2017年1月—2017年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科手術(shù)切除的胃腺癌組織標(biāo)本,共30例,術(shù)前均未接受放、化療,未同時合并其他腫瘤。患者男21例,女9例。年齡45~70歲,平均年齡(60.7±15.8)歲,中位年齡62歲。術(shù)中分別取新鮮腫瘤組織和距腫瘤邊緣超過3 cm的癌旁正常胃黏膜組織(手術(shù)后病理證實無癌細(xì)胞存在)各2份,1份于術(shù)中離體后立即放入液氮速凍,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?;?份在2 h內(nèi)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。所有患者均簽署知情同意書,本實驗獲得河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2 細(xì)胞株及試劑

    人胃癌細(xì)胞株SGC7901購置于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。TRIzol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量RT-PCR試劑為美國Promega公司產(chǎn)品。Anti-miR95、miR-95 mimics購自中國百奧邁科生物技術(shù)有限公司。miR-95熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國Signosis公司。MDR1、GST-π、LRP、Survivin及β-actin抗體購自美國Sigma公司,xIAP、Bad抗體購自英國Abcam公司。CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒購自同仁化學(xué)研究所。洛鉑為海南長安醫(yī)藥公司產(chǎn)品(每支50 mg,批準(zhǔn)文號H20050308)。

    1.3 胃癌組織單細(xì)胞懸液的制備和細(xì)胞培養(yǎng)

    取術(shù)中切除的胃癌新鮮組織1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm,在2 h內(nèi)經(jīng)充分研磨,用200目細(xì)胞篩過濾制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL,接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿,置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育。每3 d用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代,每1~2 d對培養(yǎng)基進行換液,取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

    1.4 基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組

    實驗分為miR-95 mimic或Anti-miR-95轉(zhuǎn)染組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無關(guān)序列)及空白對照組(僅轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000)。取對數(shù)生長期(傳代分瓶后48 h)的SGC7901細(xì)胞,鋪至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),待細(xì)胞融鋪滿70%~80%瓶底面積時進行轉(zhuǎn)染。首先,經(jīng)胰酶消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,然后按照轉(zhuǎn)染試劑說明書制備轉(zhuǎn)染液:在EP管中制備A液(不含血清的培養(yǎng)基稀釋miRNA)和B液(不含血清培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體),分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5 min,吸取B液加入至A液中,輕彈混勻,室溫中置10~15 min后,緩緩加入培養(yǎng)液中,輕輕搖勻,37℃孵育48 h,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染的miRNA為化學(xué)合成核酸序列,無表達載體,同時標(biāo)記有綠色熒光,可于熒光顯微鏡下直接觀察轉(zhuǎn)染效率)。

    1.5 實時熒光定量PCR法檢測胃癌組織和細(xì)胞中m iR-95的表達水平及基因轉(zhuǎn)染后目的基因轉(zhuǎn)錄水平

    用Trizol提取組織及轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,取2 mg總RNA建立20 mL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,37℃反應(yīng)30 min,將總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。使用相應(yīng)靶基因引物及Go Taq?qPCR Master Mix建立20 mL實時熒光定量PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qPCR)反應(yīng)體系,進行熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)程序如下:95℃、5 min,然后40個循環(huán)反應(yīng):94℃、30 s,58℃、30 s,72℃、30 s,于每個循環(huán)的第3個步驟(即72℃、30 s)末期收集熒光信號。U6作為micro RNA的內(nèi)參,GAPDH作為mRNA的內(nèi)參。檢測結(jié)果采用2-ΔΔCT方法計算,得到各mRNA表達的相對定量值。miR-95的檢測采用Gene Copoia公司的All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit微小RNA檢測試劑盒?;虻囊镄蛄幸姳?。

    1.6 CCK-8法檢測胃癌組織原代細(xì)胞及基因轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞對洛鉑的敏感性

    取方法1.3制備的胃癌組織細(xì)胞和胃癌細(xì)胞系以3×104個/mL的濃度接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,加入濃度為8μg/mL的洛鉑后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,各組細(xì)胞均設(shè)置6個復(fù)孔。終止培養(yǎng)后,棄去培養(yǎng)液,加入100 μL含CCK-8的培養(yǎng)液(VCCK-8∶V培養(yǎng)液=1∶9),置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀于490 nm處測吸光度D(490)值[D(490)值越小則細(xì)胞存活率越低,對化療藥物敏感性越高]。

    表1 各基因引物序列

    1.7 Western blot法檢測目的蛋白的表達

    分別提取各細(xì)胞總蛋白,并檢測蛋白濃度。取40μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)膜,封閉2 h后,加入抗 MDR1、GST-π、LRP、Survivin、xIAP、Bad、β-actin一抗,4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,經(jīng)Odyssey紅外成像系統(tǒng)分析,檢測各條帶的光密度積分值(integral value of optical density,IOD),以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白IOD值的比值代表蛋白表達水平。實驗重復(fù)3次。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,兩樣本均數(shù)比較時,使用t檢驗;對符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)比較,采用近似t檢驗;對方差不齊數(shù)據(jù)處理,用Wilcoxon檢驗;對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)兩樣本均數(shù)比較、多樣本均數(shù)比較時,用方差分析;對符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)進行比較、多個樣本均數(shù)間的兩兩比較采用最小顯著差異法(least significant difference,LSD);非正態(tài)分布或(和)方差不齊的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis H檢驗。以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-95在胃癌組織中的表達

    胃癌組織miR-95的相對表達水平(0.106±0.023)顯著高于癌旁組織(0.046±0.025)(P<0.05)。以癌組織miR-95相對表達水平的均值為界將胃癌組織分為miR-95高表達組17例,miR-95低表達組13例。

    2.2 胃癌組織中m iR-95表達水平與洛鉑敏感性的關(guān)系

    應(yīng)用CCK-8法分別檢測洛鉑對miR-95高、低表達的胃癌細(xì)胞(組織來源)的抑制率。結(jié)果顯示,洛鉑對miR-95表達水平高的胃癌細(xì)胞抑制率為(33.74±6.10)%,低于miR-95低表達的細(xì)胞(47.41±11.30)%(P<0.05)。

    2.3 anti-miR-95、miR-95 mim ics轉(zhuǎn)染對SGC7901細(xì)胞m iR-95表達的影響

    在熒光顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染效率接近100%。qPCR實驗的結(jié)果見表2。anti-miR-95轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后,miR-95mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.01);miR-95 mimics轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后,miR-95 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)。

    表2 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞miR-95 mRNA表達水平的比較(n=3,)

    表2 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞miR-95 mRNA表達水平的比較(n=3,)

    與陰性對照組及空白組比較,*P<0.05.

    組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組anti-miR-95轉(zhuǎn)染0.305±0.073*0.968±0.064 1.025±0.86 miR-95 mimics轉(zhuǎn)染18.426±1.519*1.109±0.245 1.161±0.100

    2.4 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染對SGC7901細(xì)胞對洛鉑敏感性的影響

    CCK-8實驗的結(jié)果見表3。anti-miR-95轉(zhuǎn)染后,SGC7901細(xì)胞對洛鉑的敏感性明顯增加(P<0.01);miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后,SGC7901細(xì)胞對洛鉑的敏感性明顯下降(P<0.01)。

    表3 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞SGC7901細(xì)胞對洛鉑敏感性的比較(n=3,)

    表3 anti-miR-95、miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞SGC7901細(xì)胞對洛鉑敏感性的比較(n=3,)

    與陰性對照組及空白組比較,*P<0.05.

    組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組anti-miR-95 0.526±0.141*1.120±0.106 1.180±0.119 miR-95 mimics 3.700±0.822*1.312±0.276 1.391±0.257

    2.5 miR-95對 SGC7901細(xì)胞 MDR1、GST-π、LRP、Survivin、x IAP、Bad表達的影響

    qPCR和Western blot實驗的結(jié)果見圖1和表4、5。anti-miR-95轉(zhuǎn)染后,SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MDR1、Survivin、xIAP mRNA和蛋白表達明顯降低,而Bad mRNA和蛋白表達明顯增高(P<0.05);miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后,SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MDR1、Survivin、xIAP mRNA和蛋白表達明顯增高,而Bad mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05);GST-π、LRP mRNA和蛋白表達在兩者轉(zhuǎn)染后均未見明顯改變(P>0.05)。

    圖1 Western blot檢測結(jié)果

    表4 anti-miR-95轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞MDR1、Survivin、x IAP、Bad、GST-π、LRP m RNA和蛋白水平的比較(n=3,)

    表4 anti-miR-95轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞MDR1、Survivin、x IAP、Bad、GST-π、LRP m RNA和蛋白水平的比較(n=3,)

    與陰性對照組及空白對組比較,*P<0.05.

    組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組MDR1 mRNA 0.478±0.078*1.195±0.167 1.207±0.086蛋白0.366±0.075*1.181±0.131 0.168±0.105 Survivin mRNA 0.613±0.039*1.471±0.115 1.494±0.076蛋白0.483±0.057*0.951±0.102 0.982±0.088 xIAP mRNA 0.559±0.109*1.344±0.061 1.327±0.139蛋白0.406±0.076*1.049±0.125 1.034±0.041組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組Bad mRNA 1.903±0.071*0.754±0.056 0.786±0.090蛋白0.972±0.046*0.478±0.090 0.501±0.060 GST-π mRNA 0.857±0.140 0.808±0.061 0.791±0.104蛋白0.844±0.059 0.825±0.066 0.806±0.502 LRP mRNA 1.125±0.050 1.086±0.085 1.172±0.067蛋白1.369±0.258 1.544±0.240 1.595±0.222

    表5 miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞MDR1、Survivin、xIAP、Bad、GST-π、LRP mRNA和蛋白水平的比較(n=3,)

    表5 miR-95 mimics轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞MDR1、Survivin、xIAP、Bad、GST-π、LRP mRNA和蛋白水平的比較(n=3,)

    與陰性對照組及空白對組比較,*P<0.05.

    組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組Bad mRNA 0.366±0.075*0.656±0.082 0.697±0.053蛋白0.457±0.070*1.087±0.096 0.965±0.050 GST-π mRNA 1.861±0.119 1.755±0.110 1.797±0.123蛋白0.870±0.045 0.887±0.076 0.884±0.026 LRP mRNA 1.760±0.077 1.809±0.142 1.832±0.104蛋白0.937±0.039 0.949±0.072 0.935±0.056組別轉(zhuǎn)染組陰性對照組空白對照組MDR1 mRNA 1.793±0.145*0.597±0.083 0.604±0.043蛋白1.064±0.170*0.561±0.101 0.585±0.083 Survivin mRNA 1.565±0.117*0.727±0.082 0.796±0.055蛋白0.917±0.114*0.601±0.090 0.627±0.083 xIAP mRNA 2.077±0.101*1.111±0.060 1.060±0.133蛋白1.193±0.114*0.571±0.036 0.539±0.053

    3 討論

    探討胃癌MDR機制及開發(fā)逆轉(zhuǎn)胃癌MDR藥物一直是胃癌治療領(lǐng)域的熱點與難點。研究表明,miRNA主要通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄后水平參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與耐藥[7]。有報道表明,miR-95在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中高表達,可降低非小細(xì)胞肺癌的化療敏感性、增加其放療耐受性[5]。洛鉑是第三代鉑類化療藥物,在胃癌治療中取得了較好效果[8]。但由于胃癌細(xì)胞對化療藥物多存在明顯的原發(fā)性耐藥現(xiàn)象[9],常導(dǎo)致治療效果不佳,甚至失敗。因此,探討胃癌組織細(xì)胞對洛鉑的耐藥機制有重要意義。

    本研究發(fā)現(xiàn),miR-95在胃癌組織中高表達,miR-95表達水平高的胃癌組織細(xì)胞對洛鉑敏感性低于低表達者。抑制人胃癌細(xì)胞SGC7901 miR-95的表達后再給予洛鉑干預(yù),細(xì)胞的增殖活性明顯增高;相反,提高miR-95表達后再給予洛鉑干預(yù),細(xì)胞的增殖活性明顯降低。本結(jié)果提示miR-95表達增高可能是導(dǎo)致胃癌對洛鉑耐藥的重要原因,抑制miR-95表達有可能減輕胃癌細(xì)胞對洛鉑的耐藥性。

    為探討miR-95參與胃癌組織細(xì)胞對洛鉑耐藥的機制,我們檢測了耐藥相關(guān)基因MDR1、GST-π、LRP、Survivin、xIAP、Bad在miR-95受到調(diào)控后的表達變化。MDR1是經(jīng)典MDR基因,其產(chǎn)物為P-糖蛋白(P-gp)。P-gp可將細(xì)胞內(nèi)的化療藥泵出細(xì)胞外[10-11]。GST-π通過將親脂性藥物與谷胱甘肽結(jié)合,增加其水溶性,將藥物排出細(xì)胞[12]。LRP能阻止藥物進入細(xì)胞核或?qū)⒓?xì)胞核內(nèi)的藥物泵出核外,再經(jīng)胞吐途徑排出細(xì)胞外[13-14]。腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑異常是造成MDR的另一重要機制,Survivin、xIAP、Bad均為其中重要成員,這些凋亡抑制基因的激活和凋亡促進基因的抑制使細(xì)胞耐藥性增強[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染anti-miR-95后,SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MDR1、Survivin、xIAP表達明顯降低,Bad表達明顯增高;轉(zhuǎn)染miR-95 mimics后,SGC7901細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MDR1、Survivin、xIAP表達明顯增高,而Bad表達明顯降低。同時,研究證實調(diào)控miR-95表達可影響細(xì)胞的增殖活性。有研究顯示,miR-95能夠通過促進DKK3進而激活Wnt/β-catenin信號通路導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞增殖能力增強[17];還有研究發(fā)現(xiàn)miR-95可通過調(diào)節(jié)增殖相關(guān)蛋白p21而促進肝癌細(xì)胞的增殖[18]。本研究雖然未對miR-95影響胃癌細(xì)胞增殖的機制進行深入分析,但這些結(jié)果為后續(xù)的研究提供了方向。這些結(jié)果提示,上述耐藥相關(guān)基因可能受到miR-95的調(diào)控,這可能是miR-95參與胃癌洛鉑耐藥的機制,但miR-95對這些基因調(diào)控的分子機制還有待深入研究。

    綜上所述,胃癌組織中miR-95表達水平增高,且其表達水平與胃癌細(xì)胞對洛鉑的藥物敏感性有關(guān)。miR-95可能通過調(diào)節(jié)一些耐藥相關(guān)基因如MDR1、Survivin、xIAP、Bad的表達而參與胃癌對洛鉑的耐藥形成。

    猜你喜歡
    敏感性陰性耐藥
    如何判斷靶向治療耐藥
    miR-181a在卵巢癌細(xì)胞中對順鉑的耐藥作用
    鉬靶X線假陰性乳腺癌的MRI特征
    釔對Mg-Zn-Y-Zr合金熱裂敏感性影響
    三陰性乳腺癌的臨床研究進展
    AH70DB鋼焊接熱影響區(qū)組織及其冷裂敏感性
    焊接(2016年1期)2016-02-27 12:55:37
    如何培養(yǎng)和提高新聞敏感性
    新聞傳播(2015年8期)2015-07-18 11:08:24
    hrHPV陽性TCT陰性的婦女2年后隨訪研究
    PDCA循環(huán)法在多重耐藥菌感染監(jiān)控中的應(yīng)用
    微小RNA與食管癌放射敏感性的相關(guān)研究
    观看美女的网站| 国产主播在线观看一区二区| 午夜福利欧美成人| 国产精品一及| 久久中文字幕一级| 91在线精品国自产拍蜜月 | 欧美成狂野欧美在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲人成网站高清观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 99久久成人亚洲精品观看| 中文在线观看免费www的网站| 99热精品在线国产| 日韩欧美在线乱码| 欧美日韩精品网址| 全区人妻精品视频| 精品国产亚洲在线| 欧美日韩精品网址| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产高清视频在线播放一区| 啦啦啦免费观看视频1| 国产av不卡久久| 性色av乱码一区二区三区2| 嫩草影院入口| a在线观看视频网站| 欧美在线一区亚洲| 国产精品亚洲av一区麻豆| 真人做人爱边吃奶动态| 波多野结衣高清无吗| 88av欧美| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品无人区乱码1区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 天堂√8在线中文| 欧美激情在线99| 麻豆成人午夜福利视频| 精品日产1卡2卡| 日日夜夜操网爽| 国内精品一区二区在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 搡老岳熟女国产| 亚洲av成人av| 日韩av在线大香蕉| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 波多野结衣巨乳人妻| 脱女人内裤的视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲专区字幕在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 嫩草影视91久久| 男女午夜视频在线观看| 国产乱人视频| 亚洲自拍偷在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 亚洲成av人片免费观看| 亚洲人成电影免费在线| 又爽又黄无遮挡网站| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 一级毛片高清免费大全| 不卡av一区二区三区| av福利片在线观看| 18禁观看日本| www日本黄色视频网| 亚洲18禁久久av| 99国产综合亚洲精品| 日本a在线网址| 亚洲欧美日韩高清专用| 老司机福利观看| 99热精品在线国产| 国产伦在线观看视频一区| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久香蕉精品热| 日韩人妻高清精品专区| 国产高清激情床上av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美在线一区亚洲| 麻豆成人午夜福利视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜久久久久精精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 99视频精品全部免费 在线 | 夜夜爽天天搞| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产成人欧美在线观看| 欧美大码av| 亚洲国产欧美网| 欧美日韩黄片免| 久久这里只有精品中国| 天天添夜夜摸| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 欧美乱色亚洲激情| 老汉色∧v一级毛片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 女警被强在线播放| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 麻豆一二三区av精品| 欧美日韩黄片免| 一进一出好大好爽视频| 1024香蕉在线观看| 九九热线精品视视频播放| 国模一区二区三区四区视频 | 国产综合懂色| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 香蕉久久夜色| h日本视频在线播放| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲国产精品999在线| 亚洲美女黄片视频| 九九在线视频观看精品| 国产免费男女视频| 身体一侧抽搐| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品不卡国产一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 美女免费视频网站| 久久香蕉国产精品| 亚洲精华国产精华精| 国内精品久久久久久久电影| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品一区二区精品视频观看| 日本与韩国留学比较| АⅤ资源中文在线天堂| 精品久久久久久久末码| 欧美3d第一页| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久精品91蜜桃| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久伊人香网站| 又黄又粗又硬又大视频| 此物有八面人人有两片| 岛国视频午夜一区免费看| 91av网站免费观看| x7x7x7水蜜桃| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产黄片美女视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产亚洲欧美在线一区二区| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲精品456在线播放app | 国产一级毛片七仙女欲春2| 在线观看一区二区三区| or卡值多少钱| 久久午夜亚洲精品久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 麻豆成人av在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 校园春色视频在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 怎么达到女性高潮| 啦啦啦免费观看视频1| 国模一区二区三区四区视频 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美日韩精品网址| 舔av片在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本a在线网址| 黄色丝袜av网址大全| 色综合婷婷激情| ponron亚洲| 听说在线观看完整版免费高清| 男人的好看免费观看在线视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产三级在线视频| 免费观看的影片在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲av免费在线观看| 一进一出抽搐动态| 曰老女人黄片| 久久久国产精品麻豆| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美日韩福利视频一区二区| 手机成人av网站| 久久中文看片网| 麻豆成人午夜福利视频| 又紧又爽又黄一区二区| 香蕉丝袜av| 在线播放国产精品三级| 人人妻人人澡欧美一区二区| av女优亚洲男人天堂 | 丝袜人妻中文字幕| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 国产亚洲精品久久久com| 真人做人爱边吃奶动态| 黄色女人牲交| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲av美国av| 婷婷丁香在线五月| 精品人妻1区二区| 成人午夜高清在线视频| 日日夜夜操网爽| 成人三级黄色视频| 亚洲成人久久爱视频| www日本在线高清视频| 色吧在线观看| 少妇的丰满在线观看| 九九在线视频观看精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久久久国产a免费观看| 精品欧美国产一区二区三| 手机成人av网站| 亚洲专区中文字幕在线| 国产野战对白在线观看| 欧美午夜高清在线| 午夜福利视频1000在线观看| 国内精品久久久久精免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日韩精品青青久久久久久| 九色成人免费人妻av| av视频在线观看入口| 最近在线观看免费完整版| 欧美3d第一页| 亚洲国产精品合色在线| ponron亚洲| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品 国内视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 91九色精品人成在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 1024香蕉在线观看| 黄片大片在线免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 日韩中文字幕欧美一区二区| 天堂动漫精品| 国产淫片久久久久久久久 | 国产三级在线视频| 久久香蕉国产精品| 无人区码免费观看不卡| 一级毛片高清免费大全| 日本与韩国留学比较| 制服丝袜大香蕉在线| 久久久国产成人精品二区| 亚洲国产精品合色在线| 午夜免费成人在线视频| 久久性视频一级片| 91在线观看av| 亚洲av美国av| 成熟少妇高潮喷水视频| 一区二区三区高清视频在线| 中亚洲国语对白在线视频| 成人一区二区视频在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久人妻av系列| 久久香蕉精品热| 看免费av毛片| 精品熟女少妇八av免费久了| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品久久久久久久久久久久久| 久久国产精品影院| 五月伊人婷婷丁香| 极品教师在线免费播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品国产乱子伦一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产高清有码在线观看视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日本 欧美在线| 伦理电影免费视频| 熟女电影av网| or卡值多少钱| 狂野欧美激情性xxxx| 757午夜福利合集在线观看| 一a级毛片在线观看| 青草久久国产| av福利片在线观看| 69av精品久久久久久| 国产1区2区3区精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产日本99.免费观看| 精品国产亚洲在线| 国产成人影院久久av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 九色成人免费人妻av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 午夜免费观看网址| 亚洲男人的天堂狠狠| 神马国产精品三级电影在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久久九九精品二区国产| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲成人久久爱视频| 成人精品一区二区免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产激情久久老熟女| 男女午夜视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 91字幕亚洲| 最近在线观看免费完整版| 熟女电影av网| 一夜夜www| 亚洲av电影不卡..在线观看| xxx96com| 国产成人精品久久二区二区91| 久久这里只有精品19| 国产精品一区二区免费欧美| 国内精品一区二区在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 亚洲国产看品久久| 日本一二三区视频观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产主播在线观看一区二区| 1024手机看黄色片| 久久精品国产综合久久久| av欧美777| 欧美色视频一区免费| 搞女人的毛片| 他把我摸到了高潮在线观看| 99久久国产精品久久久| 日韩精品中文字幕看吧| 精品国产三级普通话版| 欧美乱妇无乱码| 免费av不卡在线播放| 一夜夜www| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久久大精品| 亚洲国产欧美网| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 丁香六月欧美| 久久久久久国产a免费观看| 免费观看精品视频网站| 国产高清视频在线观看网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 99热只有精品国产| 亚洲在线自拍视频| 波多野结衣高清作品| 亚洲av成人精品一区久久| 在线永久观看黄色视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 麻豆成人av在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美乱妇无乱码| 成人欧美大片| 国产精品影院久久| а√天堂www在线а√下载| 国产单亲对白刺激| 手机成人av网站| 香蕉av资源在线| 日韩欧美免费精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美黄色片欧美黄色片| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲熟女毛片儿| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产高清videossex| 欧美日韩综合久久久久久 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 免费在线观看成人毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久久久久大精品| 国产精品永久免费网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 中国美女看黄片| 91九色精品人成在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 成人鲁丝片一二三区免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 禁无遮挡网站| 精品国产乱子伦一区二区三区| 免费搜索国产男女视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 黄色丝袜av网址大全| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩欧美 国产精品| 国产伦人伦偷精品视频| 91麻豆av在线| 91字幕亚洲| 嫩草影院精品99| 午夜精品在线福利| 国产亚洲精品一区二区www| 国产免费av片在线观看野外av| xxxwww97欧美| 成年女人看的毛片在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久9热在线精品视频| h日本视频在线播放| 露出奶头的视频| 最新美女视频免费是黄的| 村上凉子中文字幕在线| 麻豆国产av国片精品| 亚洲国产精品合色在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 日韩欧美国产在线观看| 成人三级黄色视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 午夜视频精品福利| 69av精品久久久久久| 手机成人av网站| a级毛片在线看网站| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产三级中文精品| 特大巨黑吊av在线直播| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 99久久成人亚洲精品观看| 美女黄网站色视频| 可以在线观看毛片的网站| 久久久精品欧美日韩精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美日韩精品网址| 久久午夜亚洲精品久久| www.自偷自拍.com| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日本在线视频免费播放| 黄片小视频在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 哪里可以看免费的av片| 91在线观看av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| av福利片在线观看| 精品一区二区三区视频在线 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲专区国产一区二区| 精品欧美国产一区二区三| 国产三级中文精品| 99久国产av精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美大码av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久中文字幕一级| 制服人妻中文乱码| 亚洲美女黄片视频| a在线观看视频网站| 99国产精品一区二区三区| 床上黄色一级片| 国产人伦9x9x在线观看| 美女大奶头视频| 国产麻豆成人av免费视频| 日本成人三级电影网站| 黄频高清免费视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 黄片小视频在线播放| 99久久成人亚洲精品观看| 国产亚洲欧美98| 亚洲专区中文字幕在线| 精品久久蜜臀av无| 国产精品av视频在线免费观看| 九色国产91popny在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 成人无遮挡网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 热99re8久久精品国产| 五月伊人婷婷丁香| 最新美女视频免费是黄的| 国产一区二区在线av高清观看| 成人永久免费在线观看视频| 久久精品91无色码中文字幕| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美黄色淫秽网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产高清三级在线| 嫩草影院精品99| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲成av人片免费观看| 精品人妻1区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美黄色片欧美黄色片| 人人妻人人看人人澡| 两个人视频免费观看高清| 熟女电影av网| 99久久精品国产亚洲精品| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 天堂网av新在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日日夜夜操网爽| 麻豆国产97在线/欧美| 国产人伦9x9x在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 在线观看日韩欧美| 国产精品98久久久久久宅男小说| 中文字幕熟女人妻在线| www.熟女人妻精品国产| 欧美又色又爽又黄视频| 久久九九热精品免费| 婷婷精品国产亚洲av| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 欧美一区二区精品小视频在线| 99在线视频只有这里精品首页| 成人特级黄色片久久久久久久| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲最大成人中文| 黄频高清免费视频| 久久精品国产综合久久久| 成人特级av手机在线观看| 怎么达到女性高潮| 欧美黑人欧美精品刺激| 日本一本二区三区精品| 18禁国产床啪视频网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲成人中文字幕在线播放| 人妻久久中文字幕网| 色在线成人网| 日本黄色片子视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产成人欧美在线观看| 欧美在线黄色| 欧美极品一区二区三区四区| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产主播在线观看一区二区| 日本在线视频免费播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲av电影在线进入| 国产精品电影一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一区二区三区国产精品乱码| 久久香蕉国产精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久国产精品麻豆| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产亚洲精品av在线| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲欧美日韩东京热| 国产成人精品无人区| 国产黄片美女视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 色精品久久人妻99蜜桃| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 午夜福利视频1000在线观看| 悠悠久久av| 99热6这里只有精品| 国产视频一区二区在线看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲av美国av| bbb黄色大片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品 欧美亚洲| 国产主播在线观看一区二区| 久久人妻av系列| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费高清视频大片| 成人欧美大片| 日韩成人在线观看一区二区三区| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜成年电影在线免费观看| 精品国产美女av久久久久小说| 久久热在线av| 九色成人免费人妻av| 亚洲国产欧美网| 香蕉丝袜av| 免费av不卡在线播放| 18美女黄网站色大片免费观看| av天堂中文字幕网| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品国产高清国产av| 亚洲黑人精品在线| 日本成人三级电影网站| 俺也久久电影网| 久久香蕉精品热| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲成av人片免费观看| 悠悠久久av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 免费看a级黄色片| www.精华液| 欧美黄色片欧美黄色片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区|