馬 陽,吳 娟,紀曉坤,王 蕊,杜 蕓*,王 珩,郭 曉,張 艷
(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院癌檢中心,河北 石家莊 050011)
肺癌是我國現(xiàn)階段發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤,嚴重威脅著人們的生命,其中非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)占肺癌類型的85%~90%。對于晚期非小細胞肺癌遠處轉(zhuǎn)移患者,放療、化療等非手術(shù)治療常對機體有害,降低了患者的生活質(zhì)量,且療效有限[1]。因此,探索肺癌發(fā)生的機制,對于肺癌患者尋找新的治療方法具有重要意義。
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是屬于酪氨酸激酶型受體,EGFR可與細胞外配體,例如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF),結(jié)合形成二聚體,啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導,調(diào)節(jié)細胞正?;顒樱ㄟ^細胞質(zhì)內(nèi)銜接蛋白和酶的級聯(lián)反應來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因,影響細胞增殖、分化、遷移、黏附及凋亡[2-4]。而在腫瘤細胞中,EGFR基因通常發(fā)生過表達或突變,引起酪氨酸活化后,會導致腫瘤細胞存活、增生、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明EGFR過表達在NSCLC細胞很常見,并且與預后不良和化療耐藥密切相關(guān)[5-7]。
自噬(autophagy)同樣廣泛存在于人體的細胞中,參與各種生理病理過程,細胞自噬過程可以降解一些蛋白與細胞器供細胞循環(huán)利用,從而維持細胞穩(wěn)態(tài)[8]。自噬活動及其相關(guān)基因的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1-light chain 3,MAP1-LC3)是參與自噬小體形成的重要蛋白,定位于自噬泡和自噬泡表面,參與自噬體的形成,是目前觀察自噬現(xiàn)象是否存在及自噬活性最為可靠的生物學指標[9]。為此,我們通過轉(zhuǎn)染體外特異性siRNA來沉默肺腺癌細胞A549的表皮生長因子受體EGFR的表達,研究其對細胞自噬活性的影響,為探索肺腺癌病理生理機制提供理論基礎(chǔ),為肺腺癌臨床治療提供新的思路。
人肺腺癌細胞株A549由河北醫(yī)科大學病理研究室提供;OPTI培養(yǎng)液、Lipofectamine?RNAiMAX Reagent和小干擾RNA均購于Invitrogengon公司;Real-time RT-PCR試劑盒購于Promega公司;總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購于北京Solarbio科技技術(shù)有限公司;鼠抗人LC3單克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體、β-actin抗體及HRP標記的抗鼠二抗均購于美國Abcam公司。
1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中,用0.25%的胰酶消化傳代培養(yǎng)。
1.2.2 EGF處理A549細胞 將處于對數(shù)生長期的A549細胞用0.25%胰酶消化后,按2×105個/mL的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中,分為4個組,分別為未處理組和EGF 10、25、50 ng/mL處理組,待作用24 h后檢測EGFR蛋白的表達水平。
1.2.3 肺腺癌細胞EGFR siRNA瞬時轉(zhuǎn)染 A549細胞按2×105個/mL接種于6孔板中,待細胞鋪滿90%~95%孔底面積時,更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。將100μL無血清OPTI培養(yǎng)液與7.5μL Lipofectamine?RNAiMAX Reagent加入無菌EP管中輕輕混勻,100 μL無血清OPTI培養(yǎng)液與原濃度為20μmol/L的EGFR特異性siRNA 5μL在另一無菌EP管中輕輕混勻后,將2個管移入1個EP管中再輕輕混勻,靜置5 min,兩者混合制備轉(zhuǎn)染復合物,室溫靜置25 min形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液,加入對應孔板中(在這一過程中動作輕柔,切忌劇烈震蕩)。以空質(zhì)粒載體組作為陰性對照。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h,實驗分為陰性對照組、EGFR siRNA-1組、EGFR siRNA-2組和EGFR siRNA-3組,分別采用Realtime RT-PCR和Western blot方法檢測EGFR mRNA和蛋白表達水平來評價3個siRNA的沉默效果。
1.2.4 細胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光PCR
Trizol法提取總RNA,具體步驟見Trizol總RNA抽提試劑盒說明書;逆轉(zhuǎn)錄SYBR Green及實時熒光PCR步驟見試劑說明書。GAPDH引物序列:上游5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′, 下 游 5′-CCTTC TCCATGGTGGTGAAGAC-3′;EGFR引物序列:上游5′-GTGACCGTTTGGGAGTTGAT-3′, 下 游 5′-GGGC GACTATCTGCGTCTAT-3′;GAPDH作為內(nèi)參。
1.2.5 Western blot法檢測 利用RIPA裂解液提取細胞總蛋白,用以檢測EGFR蛋白表達,蛋白濃度測定后,按每孔20μL上樣量用Loading Buffer配平,沸水加熱后上樣,行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳,轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。經(jīng)洗滌后,加入一抗(鼠抗人EGFR抗體1∶1 000稀釋,鼠抗人LC3抗體1∶2 000稀釋,β-actin抗體1∶5 000稀釋),37℃孵育1h后4℃過夜;PBST洗滌后加入二抗(HRP標記的抗鼠二抗1∶5 000稀釋)。洗滌膜后,利用Easy See化學發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光,顯影。用Image Tool測量目的蛋白條帶盒內(nèi)參條帶的灰度值,以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對表達水平。
1.2.6 沉默EGFR表達后檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達 A549細胞分為4組:EGFR siRNA組,空載體組,轉(zhuǎn)染試劑組(加入轉(zhuǎn)染試劑)和空白對照組。4組同時加入等量濃度為50 ng/mL EGF處理24 h后,收集細胞。Western blot方法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達情況。
1.2.7 透射電子顯微鏡觀察自噬小體 A549細胞分為2組:EGFR siRNA組和空載體組。用配制好2.5%戊二醛固定液固定各組細胞,放入4℃冰箱保存,且無劇烈晃動,固定至少1 h后送電鏡室。用1/15 mol/L的磷酸緩沖液洗滌標本3次,每次約15 min;用1%四氧鋨酸固定標本1~2 h,4℃冰箱保存;用磷酸緩沖液再次洗滌標本3次,每次約15 min;經(jīng)50%、70%、80%、90%的丙酮濃度梯度脫水,各1次,約15 min,100%丙酮浸入15 min,2次;包埋劑浸透3 h,室溫或過夜:100%丙酮與包埋液比例為1∶1,37℃、60 min;100%丙酮與包埋液比例為1∶3,37℃、過夜;純包埋液浸透37℃、5 h。用環(huán)氧樹脂把標本包埋在包埋板或者膠囊中,然后依次置于37℃、24 h;60℃、48 h,進行聚合;用超薄切片機靶標被切成超薄切片,厚約50 nm,接著用醋酸雙氧鈾染色30~45 min,檸檬酸鉛染色5~30 min,透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)自噬小體情況。
1.2.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理,實驗結(jié)果用xˉ±s表示,兩組間比較采用t檢驗或Wilcoxon符號秩檢驗,多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗,以α=0.05為檢驗水準。
在肺腺癌A549細胞中加入不同濃度的EGF,用Western blot法檢測EGFR蛋白的相對表達水平,結(jié)果見圖1,可見未處理組和10、25、50 ng/mL EGF處理組的EGFR蛋白相對表達水平分別為0.42±0.02和0.55±0.03、0.94±0.04、4.34±0.16,顯示EGFR蛋白的表達水平隨EGF濃度的增加而升高。
圖1 不同濃度EGF處理肺腺癌A549細胞后EGFR蛋白表達
Western blot檢測結(jié)果見圖2,陰性對照組以及轉(zhuǎn)染EGFR siRNA-1、EGFR siRNA-2、EGFR siRNA-3后,肺腺癌A549細胞EGFR蛋白相對表達水平分別為0.67±0.02、0.30±0.02、0.63±0.07、0.56±0.03。用Real-time RT-PCR法檢測陰性對照組與EGFR siRNA-1組細胞的EGFR mRNA表達水平,結(jié)果見圖3,顯示分別為1.06±0.24、0.10±0.01,表明siRNA-1可明顯降低EGFR表達(P均<0.05),因此采用EGFR siRNA-1進行后續(xù)實驗。
圖2 Western b lot方法檢測siRNA對A549細胞EGFR蛋白表達的沉默效果
圖3 Real-time RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染EGFR siRNA-1后A549細胞EGFR m RNA的表達
Western blot法檢測轉(zhuǎn)染EGFR siRNA后A549細胞自噬效應分子LC3蛋白表達情況,結(jié)果見圖4,顯示轉(zhuǎn)染EGFR siRNA組細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比例高于其他3組(P<0.05);空載體組,轉(zhuǎn)染試劑組(加入轉(zhuǎn)染試劑)和空白對照組細胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比例無明顯差異(P>0.05)。實驗表明抑制EGFR表達可以提高肺腺癌A549細胞自噬活性。
圖4 Westernblot方法檢測不同處理組A549細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達
電鏡觀察結(jié)果見圖5,在電鏡視野下,自噬小體為雙層或多層膜的球狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含胞漿成分,如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等??梢娤啾瓤蛰d體組,EGFR siRNA組細胞中自噬小體數(shù)量顯著增多??梢姵聊珽GFR基因后,經(jīng)電鏡直觀顯示A549細胞自噬活性升高。
本實驗研究表明,首先,應用特異性EGFR siRNA可以在RNA水平和蛋白水平有效降低表皮生長因子受體EGFR的表達量,成功實現(xiàn)EGFR基因轉(zhuǎn)錄后沉默效應。其次,在加入表皮生長因子EGF條件下,通過特異性EGFRsiRNA干擾技術(shù)降低EGFR表達,實驗通過抑制EGFR表達可以提高肺腺癌A549細胞自噬活性,會誘導自噬活性的增加。WEI[10]等通過EGF刺激及血清饑餓處理兩項條件下已有證實增強EGFR信號通路可以降低細胞自噬的活性。而我們通過應用特異性siRNA干擾技術(shù),逆向證明降低EGFR表達量,可以誘導自噬增加。再次,我們通過透射電子顯微鏡更加直觀的觀察,在加入EGF處理下,EGFRsiRNA轉(zhuǎn)染入細胞后與對照組相比,細胞內(nèi)出現(xiàn)大量雙層杯狀膜包裹的細胞內(nèi)容物的自噬小體。
圖5 透射電子顯微鏡顯示A549細胞超微結(jié)構(gòu)
RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)是非常重要的生物學研究工具,并且在基因治療方面表現(xiàn)出巨大的潛力[11]。研究表明RNAi包括兩個關(guān)鍵的部分:siRNA的合成和iRNA與沉默復合物(RISC)結(jié)合來介導RISC地靶mRNA的切割,最終誘發(fā)放大沉默信號,進而關(guān)閉相關(guān)的蛋白表達[12-15]。本實驗中應用特異性EGFRsiRNA可以在RNA水平和蛋白水平有效降低表皮生長因子受體EGFR的表達量,成功實現(xiàn)EGFR基因轉(zhuǎn)錄后沉默效應。
EGFR是一種廣泛分布于機體各組織細胞膜上的多功能跨膜糖蛋白,可與EGF結(jié)合形成二聚體發(fā)生交聯(lián)磷酸化,待激活細胞內(nèi)TK區(qū)后會激活以下信號通路傳導:Ras/MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路、STAT信號通路和Beclin1信號通路[16]。配體EGF對EGFR信號通路內(nèi)在化作用有明顯的影響。KUMA[17]等研究表明,在不同劑量EGF的誘導會導致EGFR復合物內(nèi)在化的途徑和效果不同。因此在實驗中選擇不同濃度梯度的EGF,對細胞進行處理,結(jié)果顯示隨著EGF濃度升高,EGFR表達呈濃度依賴性升高。
另一方面,細胞自噬是胞漿內(nèi)長壽蛋白和多余的細胞器通過自噬作用被包裹形成自噬小體,消化降解為氨基酸、脂肪酸等供細胞循環(huán)利用,重新合成大分子有機物和ATP,進而維持細胞的正常代謝[18]。自噬相關(guān)蛋白LC3可分為三種亞型,其中LC3B亞型與自噬關(guān)系最為密切。通常我們對LC3的檢測即對LC3B的檢測。一般情況下,細胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯合成的LC3經(jīng)過加工,會形成LC3-Ⅰ;當細胞發(fā)生自噬時LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾,進而與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,便形成LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上,則意味著自噬小體的最終形成,因此,LC3-Ⅱ的含量與自噬泡的數(shù)量(即自噬的活性)呈正比[19-20]。細胞自噬與許多疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系,尤其是自噬作用及自噬因子的調(diào)節(jié)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。細胞自噬與許多疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。自噬可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的微環(huán)境的關(guān)系來促進腫瘤的生長[21-22]。當腫瘤細胞處于低氧等壓力環(huán)境時,缺氧誘導因子1α(hypoxiainducible factor 1α,HIF-1α)和 BCL2/腺病毒EIB19kd結(jié)合蛋白(BCL-2/adenovirus EIB 19kdinteracting protein 3,BNIP3)被激活,阻止BCL-2和Beclin1的相互作用,從而激活自噬通路來促進腫瘤細胞對于低氧的應對能力[21-23]。另一方面,自噬對腫瘤也有抑制作用,自噬的異??蓪е露喾N抑癌基因的失活和癌基因的激活,有研究顯示小鼠模型的胰腺細胞經(jīng)致癌物誘導后,所形成的癌前病灶及腺瘤的自噬能力增加,但當癌細胞形成后自噬活性就會下降[24]。此外,在Braf誘發(fā)的肺癌模型以及Atg7沉默的腫瘤模型中會出現(xiàn)脂代謝受損,對于缺乏自噬活性的腫瘤細胞來說,會降低其處理調(diào)節(jié)營養(yǎng)缺失的能力[25]。由此可見,自噬不僅對細胞正常生理狀態(tài)有調(diào)節(jié)作用,同時也對腫瘤細胞有雙重作用,并且對腫瘤細胞的代謝有調(diào)節(jié)作用。
綜上所述,在腫瘤細胞中,通過調(diào)節(jié)EGFR基因表達,經(jīng)下游信號通路傳導后,最終對自噬活性有明顯的影響,但由于自噬對腫瘤細胞作用較為復雜,需要更深入全面的研究,才能更能明確了解自噬與EGFR信號通路在肺腺癌病理生理機制,進而為肺腺癌臨床治療提供理論基礎(chǔ)。