肉蓯蓉提取物對快速老化模型小鼠SAMP8行為學及腸道菌群的影響＊

付志飛，楊 麗，尚 非，戴永娜，趙 鑫＊＊

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院 天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學臨床實訓教學部 天津 301617）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease,AD）是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因及發(fā)病機制尚未闡明，至今尚無有效的防治藥物，且隨著人口老齡化發(fā)展，發(fā)病率逐年升高[1]。目前臨床上用于治療AD的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，但存在療效不確切、作用靶點單一、毒副作用大的缺點。因此，研發(fā)高效、低毒、多靶點的阿爾茲海默病防治藥物是臨床治療的迫切需求。肉蓯蓉具有抗阿爾茲海默病作用，目前對其抗阿爾茲海默病研究大多集中于苯乙醇苷類化合物，肉蓯蓉總苷可以提高SAMP8小鼠空間學習記憶能力，降低腦組織丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及海馬體細胞的存活率[2]，但此類化合物口服后代謝途徑廣泛，生物利用度極低，難以解釋其體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。而肉蓯蓉另一主要成分為多糖，前期文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)其具有增強免疫、抗氧化及抗腫瘤等作用[4]，在胃腸道內(nèi)二者將不可避免地相互作用。本部分旨在研究肉蓯蓉不同組分單獨使用與聯(lián)合使用對SAMP8 小鼠的學習記憶及腸道菌群的影響，以期為開發(fā)肉蓯蓉開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

8.5 月齡雄性SAMP8 快速老化小鼠和8.5 月齡雄性SAMR1 正常老化小鼠，SPF 級，均由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，動物飼養(yǎng)于天津市放射醫(yī)學研究所，室溫23±2℃。相對濕度58-65%。

1.1.2 試劑與藥材

肉蓯蓉，購自內(nèi)蒙古阿拉善盟，內(nèi)蒙古曼德拉沙產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，經(jīng)鑒定為荒漠肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma。肉蓯蓉藥材3.0 kg，切片，45℃烘干，粉碎后，加入85%乙醇，60℃下提取兩次，每次2 h，料液比分別為1∶12，1∶10。提取液經(jīng)濃縮后，D101大孔樹脂純化，制備液相分離，制得松果菊苷，純度經(jīng)HPLC 法測定為96.2%。藥渣揮干乙醇后，100℃沸水提取，料液比分別為1∶12，1∶10，提取2次，每次2 h，提取液趁熱離心，濃縮后，加入95%乙醇調(diào)節(jié)乙醇的終濃度為80%，4℃醇沉過夜，沉淀用無水乙醇洗滌數(shù)次，得肉蓯蓉粗多糖，提取率約為11.0%。

1.1.3 實驗儀器與試劑

Morris 水迷宮設(shè)備（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）：包括不銹鋼恒溫水池、電腦攝像系統(tǒng)、配套軟件分析系統(tǒng)；美國Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)：配置在線真空脫氣機（G1379B）、高壓四元梯度泵（G1312A）、自動進樣器（G1328A）、柱溫箱（G1316A）、二極管陣列檢測器（G1314A）（美國Agilent 公司）；色譜柱：Waters XTerra RP18，4.6×250 mm，5μm（美國waters 公司）；松果菊苷標準品（上海源葉生物有限公司）；糞便DNA提取試劑盒（Qiagen，德國）；超純水設(shè)備（美國Millipore公司）；乙腈為色譜純（美國Fisher）；其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥

實驗動物共分為5組：SAMR1正常對照組（n=10）、SAMP8 模型組（n=9）、肉蓯蓉多糖組（ZT，n=14）、松果菊苷組（ECH，n=11）以及肉蓯蓉多糖和松果菊苷聯(lián)合給藥組（n=13），每天灌胃給藥1次，連續(xù)31 d，ZT組給藥劑量200 mg·kg-1，ECH 組給藥劑量60 mg·kg-1，ZT+ECH組給藥劑量200 mg·kg-1ZT+60 mg·kg-1ECH，SAMR1 組給予同體積的生理鹽水。第26 d 于無菌條件下采集糞便，第27-31 d進行水迷宮實驗，期間不間斷給藥，第32 d處死，解剖，取胸腺、脾臟，計算胸腺、脾臟指數(shù)并進行統(tǒng)計。

1.2.2 Morris水迷宮實驗

根據(jù)文獻方法[5]，進行Morris 水迷宮實驗，包括定位航行實驗和空間探索實驗。水迷宮置于房間中間，為一圓形水池，水溫保持在±22℃。將水池等分為東（E）、南（S）、西（W）、北（N）四個象限，在一象限中心放置一圓形平臺，平臺低于水面2 cm。水迷宮正上方高處裝有一個小型攝像機，并與錄像機和監(jiān)視器連接，記錄小鼠的游泳軌跡和游泳時間。觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動情況。在第27 d，每天上、下午定位航行訓練各一次，連續(xù)4 d。每天將小鼠面向池壁分別從2個不同的標記點輕輕放入水中，記錄60 s 內(nèi)其找到水下平臺所花費的時間（逃避潛伏期，escape latency），找到平臺后允許小鼠在平臺上停留10 s，如果小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，則引導小鼠登上平臺，并在平臺上停留10 s，讓其根據(jù)周圍參照物進行空間學習記憶。第5 d移除隱藏的平臺，按同一地點將小鼠放入水池，記錄60 s內(nèi)小鼠經(jīng)過平臺的總次數(shù)及原平臺象限的活動時間。

1.2.3 糞便微生物DNA 提取及Illumina HiSeq 高通量測序

DNA 提取：在試驗第26 d 取SAMR1 組、SAMP8組、ZT組、ECH組以及ZT+ECH組小鼠糞便，每組3只，由于水迷宮實驗效果不佳，前期文獻調(diào)查也發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉抗AD作用主要藥效物質(zhì)為苯乙醇苷[2,3]，因此我們僅選取SAMR1 組、SAMP8 組、ECH 組以及ZT+ECH 組小鼠糞便，采用Qiagen DNA 提取試劑盒提取DNA，提取后送至諾禾致源公司進行Illumina HiSeq2500 高通量測序，得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Sequenced Reads），其中包含測序序列（Reads）的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。通過對Reads 拼接過濾，OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，并進行物種注釋及豐度分析；進一步進行α多樣性分析（αDiversity）、β多樣性分析（βDiversity）和顯著物種差異分析等。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均以平均值±標準差（x±S）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 說明有顯著性差異，P＜0.01說明有非常顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 對生存率的影響

SAM 鼠是研究衰老相關(guān)學習記憶障礙機制和藥物篩選的理想動物模型。SAMP8鼠在渡過約4-6月齡的正常生長期后，迅速出現(xiàn)老化特征，往往伴隨有學習記憶能力障礙、毛發(fā)脫落、免疫系統(tǒng)缺陷、晝夜節(jié)律異常、腦萎縮、神經(jīng)元丟失及β淀粉樣蛋白沉積等病理特征[6]。本實驗中8.5 月齡SAMP8 小鼠喂養(yǎng)過程中伴有毛發(fā)脫落、皮膚和生殖器潰爛、脊柱后凸等特征，各組小鼠出現(xiàn)陸續(xù)死亡現(xiàn)象。給藥31 d后，SAMR1小鼠生存率為80%（小鼠喂養(yǎng)過程中偶有打架現(xiàn)象，導致1只小鼠死亡；水迷宮期間將小鼠從SPF級動物房中拿出，出現(xiàn)1 只小鼠死亡），SAMP8 模型組、ECH 組、ZT 組以及ECH+ZT 組小鼠生存率分別為67%、64%、71%以及85%。模型組、ZT組和ECH組小鼠均出現(xiàn)生殖器潰爛至死亡現(xiàn)象，但ECH+ZT組未出現(xiàn)生殖器潰爛的現(xiàn)象，且小鼠活潑好動。與模型組相比，肉蓯蓉多糖和聯(lián)合給藥均能延長SAMP8小鼠生存率，改善小鼠的生存質(zhì)量（圖1）。

2.2 對體重及臟器指數(shù)的影響

與SAMR1正常組小鼠相比，SAMP8模型組小鼠體重降低（圖2），但是無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組小鼠相比，給藥組小鼠體重略有升高，但也無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與SAMR1組小鼠相比，SAMP8小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均無顯著性變化（圖3）；與SAMP8小鼠相比，給藥組小鼠也無明顯的改善，但多糖組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)有所提高，提示肉蓯蓉多糖可能對SAMP8小鼠有免疫增強作用。

2.3 對行為學的影響

對每天2 次訓練結(jié)果進行統(tǒng)計，實驗結(jié)果用每組小鼠平均潛伏時間±SD表示。在Morris 水迷宮定位航行實驗中，SAMR1組小鼠潛伏期呈下降趨勢。自第2 d起，與正常組比較，模型組小鼠潛伏期明顯長于正常組；隨著訓練天數(shù)的延長，ZT、ECH 及ZT+ECH 組與模型組比較潛伏期時間并沒有明顯縮短（圖4）。在Morris水迷宮空間探索實驗中，與SAMR1 組比較，模型組穿越平臺次數(shù)和進入有效區(qū)域次數(shù)減少；與模型組相比較，給藥組小鼠穿越平臺次數(shù)無增加（表1）。雖然ZT組進入有效區(qū)域次數(shù)增多，但在水中表現(xiàn)為懶惰、偏愛漂浮在一個位置不動的現(xiàn)象。

2.4 對腸道微生物的影響

2.4.1 對物種豐度的影響

圖1 SAMP8小鼠生存曲線

圖2 肉蓯蓉提取物對SAMP8小鼠體重的影響

圖3 肉蓯蓉提取物對SAMP8小鼠臟器指數(shù)的影響

圖4 Morris水迷宮逃避潛伏期時間

表1 各組小鼠空間探索實驗結(jié)果

16S 測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、過濾、去嵌合體，得到優(yōu)化的序列，使用QIIME 軟件進行OUT 聚類分析，利用Silva 數(shù)據(jù)庫進行注釋，獲得各樣本在門、綱、目、科、屬、種分類水平上的組成和豐度。結(jié)果顯示，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門在各組小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)中占有絕對優(yōu)勢，SAMR1組：擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門的相對豐度分別為47.4%、39.5%、8.6%；SAMP8 組：三者相對豐度分別為48.9%、42.0%、5.0%；ECH 組：三者相對豐度分別為59.3%、27.3%、9.6%；ZT+ECH 組：三者相對豐度分別為61.0%、28.4%、6.9%。在門水平上，與SAMR1 組相比，SAMP8 組小鼠厚壁菌門豐度升高，變形菌門豐度降低，而ECH 及ECH+ZT均能增加擬桿菌門、變形菌門豐度，降低厚壁菌門豐度；在屬水平上，各組中豐度較高的為擬桿菌屬細菌（Bacteroides）、理研菌屬（Alistipes）和毛螺菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）（圖5），與SAMP8模型組小鼠相比，ECH 及ECH+ZT 組bacteroides、理研菌（Rikenellaceae_RC9_gut_group）豐度上升，Lachnospiraceae_NK4A136_group和Alistipes豐度下降。

圖5 物種相對豐度柱形圖

與SAMR1小鼠相比，SAMP8小鼠雖然主要的腸道菌群豐度并未發(fā)生顯著的改變，在門水平上，SAMP8組小鼠厚壁菌門豐度升高，變形菌門豐度降低，而ECH及ECH+ZT擬桿菌門、變形菌門豐度增加，厚壁菌門豐度降低，但無統(tǒng)計學意義；而豐度較低的綠菌門（Chlorobi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、TM6 門、衣原體門（Chlamydiae）、螺旋體門（Spirochaetes）、綠灣菌門（Chloroflexi）顯著性上調(diào)（P＜0.05，t-test），疣微菌門（Verrucomicrobia）顯著性下調(diào)（P＜0.05，t-test），此外有7 個綱、14 個目、29 個科、31個屬、16個種的細菌豐度也發(fā)生顯著改變。

ECH 雖然對高豐度的SAMP8 小鼠腸道菌群無明顯調(diào)節(jié)作用，但能顯著升高模型組低豐度綠菌門細菌，降低TM6 門細菌；ECH 和ZT 聯(lián)合給藥組對模型組小鼠低豐度腸道菌群的逆轉(zhuǎn)作用更明顯，具體表現(xiàn)在門水平上顯著降低浮霉菌門、酸桿菌門、TM6 門、螺旋體門等豐度，顯著升高Parcubacteria、疣微菌門等細菌豐度（P＜0.05，t-test）。

2.4.2 對物種多樣性的影響

采用α和β多樣性分析菌群的整體結(jié)構(gòu)。α多樣性反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性，有多種衡量指標：Chao1、ACE、Shannon、Simpson 等。Chao1 和ACE指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少，Shannon和Simpson 指數(shù)用于衡量物種多樣性。SAMP8 小鼠物種多樣性最高（表2）。ECH 和ECH+多糖組均未能改善Observed species、Shannon、Chao1 和ACE 指數(shù)，說明ECH和聯(lián)合給藥組未能提高SAMP8小鼠腸道菌群α多樣性，原因可能跟樣本量少，個體差異大有關(guān)。

表2 α多樣性指數(shù)統(tǒng)計表

β多樣性分析主要是利用各樣本的物種組成及豐富信息來反映樣本間關(guān)系。如果樣品的群落組成越相似，則它們在主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）圖中的距離越接近，反之，差異越大，距離越遠。PCA 圖中，模型組和ECH 組沒有明顯分開，提示ECH 對模型組小鼠腸道菌群多樣性影響不明顯（圖6a）?；赨nweighted Unifrac 距離進行PCoA 分析（圖6b），并選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖展示，結(jié)果同樣顯示ECH+ZT 聯(lián)合給藥組菌群多樣性和SAMR1組相近，而SAMP8組和ECH組較相近，說明聯(lián)合給藥組改善腸道菌群效果優(yōu)于松果菊苷單獨用藥。PCA 及PCoA 分析均提示，SAMP8 與SAMR1 小鼠腸道菌群差距較大，而聯(lián)合給藥組可較大程度的逆轉(zhuǎn)腸道菌群的改變。

圖6 a PCA分析圖

圖6 b 基于Unweighted Unifrac 距離PCoA分析圖

3 討論

文獻報道，肉蓯蓉70%乙醇提取物有增加8 月齡SAMP8快速衰老小鼠的外周血和脾初始T細胞和自然殺傷細胞、降低促炎因子、延長生命周期的作用[7]。苯乙醇苷提高突觸可塑性，改善SAMP8 小鼠認知，其對腦損傷的保護機制與可能與其增強自由基清除酶活性，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)相關(guān)[8,9]。多糖大多數(shù)不能被人體消化，但是能被腸道菌群中的多種酶降解為更小分子的寡糖和單糖發(fā)揮作用，且能扶植腸道益生菌的生長[10]。文獻報道，通過腸道微生物介導，多糖與小分子化合物聯(lián)用有增效的作用，如人參多糖促進人參皂苷的體內(nèi)轉(zhuǎn)化[11]、黨參水煎液中共存的多糖促進皂苷的吸收[12]。Morris 水迷宮是AD 研究中評價動物學習記憶的經(jīng)典方法。潛伏期、尋求次數(shù)反映小鼠學習、記憶能力，其值越短，說明小鼠學習、記憶能力越強。本實驗肉蓯蓉多糖和松果菊苷單用或是聯(lián)合使用對8.5月齡SAMP8小鼠學習記憶行為學無改善作用，提示肉蓯蓉多糖和松果菊苷對SAMP8小鼠的抗AD作用可能具有年齡依賴性[13]。ZT及ECH+ZT組小鼠生存率明顯提高，特別是聯(lián)合給藥組未發(fā)生生殖器潰爛的現(xiàn)象，小鼠的精神狀態(tài)和身體狀態(tài)都有改善，提示多糖可能具有增強免疫的作用。

腸道的微生物以相對恒定的比例長期生活在腸道內(nèi)。菌群的動態(tài)平衡與穩(wěn)定在維持機體健康方面發(fā)揮重要作用。研究表明，腸道和大腦之間存在著腦-腸軸，腸道菌群的穩(wěn)態(tài)與阿爾茲海默病、抑郁癥等神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病相關(guān)[14]。隨著年齡的增長，腸道有益菌比例逐漸降低。鑒于目前肉蓯蓉對于SAMP8 小鼠腸道微生物的影響尚不清楚，我們在本研究中使用Illunima 高通量測序方法檢測肉蓯蓉組分對于小鼠的腸道微生物的調(diào)節(jié)作用。前期文獻報道，SAMP8小鼠菌群失調(diào)與認知功能下降相關(guān)，在門、綱、目等水平上，共有27種細菌發(fā)生顯著改變，其中26種細菌，包括脫鐵桿菌門，顯著降低，1 種顯著升高。PCoA 分析也表明SAMP8 和SAMR1 小鼠腸道菌群顯著不同[15]。本實驗結(jié)果也同樣提示SAMP8小鼠菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，肉蓯蓉多糖和松果菊苷聯(lián)合給藥可較大程度的逆轉(zhuǎn)腸道菌群的改變，但是具體作用機制還有待進一步的研究。肉蓯蓉作為補益類中藥，在臨床中有廣泛的應(yīng)用，本研究提示我們，肉蓯蓉不同組分抗AD 活性可能具有時間依賴性，松果菊苷及松果菊苷和多糖聯(lián)合應(yīng)用具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，該研究為肉蓯蓉有效成分的開發(fā)利用提供科學依據(jù)，為治療AD 疾病提供臨床參考。