Thermotoga sp. RQ7內(nèi)切纖維素酶TsCel12A蛋白的酶學(xué)性質(zhì)和晶體學(xué)研究

李 媛，張 麗，陳安琪，季朝能

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

自然界中糖類至關(guān)重要.葡萄糖為生命體提供能量，脫氧核糖參與有機(jī)體遺傳物質(zhì)的組成，糖蛋白承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)交流的使者，光合作用合成的木質(zhì)纖維素則是地球上最豐富的可再生資源[1]，蘊(yùn)藏著巨大的應(yīng)用前景.根據(jù)CAZy(Carbohydrate-Active Enzymes)數(shù)據(jù)庫，作用于碳水化合物的酶可分為五大類，其中糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases, GHs)(EC 3.2.1)又稱糖苷酶或糖基水解酶，可以催化O-，N-，S-糖苷鍵形成半縮醛糖或半縮酮糖和相應(yīng)的糖苷配基[2]，按水解過程中產(chǎn)物糖分子異頭碳羥基的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是否發(fā)成變化，分為保留型或反轉(zhuǎn)型兩種催化機(jī)制[3].在糖苷水解酶中，涉及能源、食品、醫(yī)藥、化工原料等諸多領(lǐng)域[4]，應(yīng)用前景[5-7]最大的一類酶為水解纖維素的酶類[8].在長期的進(jìn)化過程中，纖維素為抵御被水解形成了復(fù)雜致密的超分子聚合結(jié)構(gòu)，現(xiàn)普遍接受的纖維素降解過程是由內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶進(jìn)行協(xié)同作用[9-10].內(nèi)切纖維素酶(EC 3.2.1.4)是參與纖維素水解反應(yīng)第一步的酶類，其底物廣泛[11]，可作用于纖維素、木聚糖、木葡聚糖、β-葡聚糖[12]等，其活性中心的三維結(jié)構(gòu)通常為一個(gè)開放的裂隙[13]，助于與底物的結(jié)合，對(duì)非結(jié)晶區(qū)的糖鏈進(jìn)行隨機(jī)切割，產(chǎn)生寡糖和還原末端.目前關(guān)于內(nèi)切纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能報(bào)道分散在不同家族，在CAZy數(shù)據(jù)庫中僅有少數(shù)成員的三維結(jié)構(gòu)被收錄，極大限制了我們對(duì)其發(fā)揮水解作用機(jī)制的理解.

在工業(yè)上，降解纖維素等原料的方法包括有研磨爆破等物理處理、酸堿有機(jī)溶劑等化學(xué)處理、以及酶處理.采用物理和化學(xué)處理往往成本較高且極易污染環(huán)境，將環(huán)保高效的水解酶而非化學(xué)制劑用于工業(yè)生產(chǎn)的需求越來越多.然而部分天然酶在工業(yè)應(yīng)用時(shí)常存在缺陷[14]，獲得能耐受工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的酶制劑成為亟待解決的科學(xué)難題[15-16].1983年Ulmer提出了分子水平對(duì)酶進(jìn)行改造的蛋白質(zhì)工程(Protein engineering)[17].值得注意的是: 通過隨機(jī)突變或定向篩選[18]而獲得的功能改善酶分子的過程耗時(shí)較長，且易發(fā)生酶的表達(dá)量或活性偏低等問題；通過轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾而獲得的酶在催化的高效性和折疊穩(wěn)定性上往往存在問題.相比而言，如果可以從極端微生物中篩選出耐高溫、高鹽及酸堿環(huán)境的酶，并掌握其三維結(jié)構(gòu)，無論是將其直接應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，還是將其視為功能單元串聯(lián)構(gòu)建雜合酶，亦或是針對(duì)其活性催化結(jié)構(gòu)域的再設(shè)計(jì)，都具備極高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值.因此，本課題希望能通過酶學(xué)性質(zhì)的測定篩選出具備工業(yè)應(yīng)用特性的內(nèi)切纖維素酶[19]，開辟工業(yè)纖維素處理中酶制劑的環(huán)保應(yīng)用路徑；并通過三維結(jié)構(gòu)的解析，探究出內(nèi)切纖維素酶與纖維素等底物的結(jié)合和催化機(jī)制，為纖維素水解技術(shù)的革新提供思路，進(jìn)而推動(dòng)利用可再生資源解決能源危機(jī)，促進(jìn)世界的可持續(xù)發(fā)展.

本文在前期對(duì)來自10種不同菌株的內(nèi)切纖維素酶降解底物對(duì)硝基苯-β-D-纖維二糖苷研究的基礎(chǔ)上，報(bào)道降解效果最好的來源于Thermotogasp. RQ7的內(nèi)切纖維素酶TsCel12A的表達(dá)、純化、酶學(xué)性質(zhì)和X-射線晶體衍射的初步分析結(jié)果，希望這些工作能為內(nèi)切纖維素酶類結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的闡明及其在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供借鑒意義.

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌E.coliBL21(DE3)菌株、質(zhì)粒pFD1由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供.

1.2 TsCel12A重組表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒合成自: 蘇州金唯智生物科技有限公司，將來源于Thermotogasp. RQ7的目的基因片段(GCGGAGGTCGTACTTACCGATATCGGGGCTACAGATATTACGTTCAAAGGTTTTCCAGTGAC-AATGGAACTCAATTTTTGGAACGTTAAGTCTTATGAAGGCGAGACTTGGTTAAAATTCGACG-GTGAAAAAGTCCAGTTTTACGCAGATATTTATAATATCGTATTGCAAAACCCTGATTCCTGG-GTGCACGGGTACCCAGAAATTTATTACGGTTATAAGCCTTGGGCCGCTCATAATTCAGGCACC-GAGATTCTGCCGGTTAAAGTCAAAGACCTTCCAGATTTTTACGTAACACTCGATTATTCGAT-CTGGTACGAAAACGACTTACCTATTAATTTGGCAATGGAAACGTGGATTACACGCAAGCCAG-ATCAGACTAGTGTGAGCTCTGGTGATGTTGAGATCATGGTCTGGTTCTATAACAATATTCTG-ATGCCTGGGGGTCAAAAAGTAGACGAATTTACCACAACGATTGAAATCAACGGCTCCCCGGT-GGAGACAAAATGGGATGTTTACTTTGCGCCATGGGGTTGGGATTATCTTGCTTTCCGTCTCA-CTACCCCTATGAAGGACGGGCGTGTCAAATTTAATGTAAAAGATTTTATGGAAAAGGCAGCC-GAAGTGATTAAAAAATACTCAACACGCGTTGAGAACTTCGAAGAAATGTATTTTTGTGTCTG-GGAGATTGGTACGGAATTTGGCGATCCAGACACAACTGCTGCAAAGTTCGGTTGGACCTTTA-AAGATTTTTCGGTAGAAACAAAATAACTCGAG)通過限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接質(zhì)粒片段，構(gòu)建出pFD1-His-TsCel12A重組表達(dá)載體，保存于E.coliDH5α菌株.采用Axygen質(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，并制成25%甘油菌于-20℃凍存.

1.3 TsCel12A的表達(dá)與純化

吸取甘油菌接種于含有50μg/mL氨芐青霉素和34μg/mL氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下200r/min培養(yǎng)過夜.再按每20mL過夜菌接種于1L含有50μg/mL氨芐青霉素和34μg/mL氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，共搖菌8L于37℃擴(kuò)大培養(yǎng).待菌濃度值OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，降溫至16℃，加入0.5mmol/L IPTG繼續(xù)培養(yǎng)20h.5000r/min離心10min收集菌體，用緩沖液A(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑)冰上重懸，采用聚能高壓細(xì)胞破碎儀破碎菌體后，于4℃條件下15000r/min離心40min留取上清.

目的蛋白的純化采用Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析的方法進(jìn)行.先將上清借助AKTA層析儀上樣到GE Healthcare公司5mL的HisTrapTMHP預(yù)裝柱(已用緩沖液A平衡)中，待目的蛋白吸附在層析柱后，用緩沖液B(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，300mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑)自8%起始至100%梯度洗脫，收取每一個(gè)蛋白峰的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證.將蛋白條帶大小正確的洗脫樣品濃縮至5mL，上樣于GE公司HiPrep 26/60 Sephacryl S100凝膠過濾層析柱(已用緩沖液C平衡)，用緩沖液C(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，1mmol/L DTT)平衡洗脫，收集出峰樣品.進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，并切下目的帶膠條，送樣于質(zhì)譜檢測平臺(tái)進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析.確認(rèn)純化所得為目的蛋白后，濃縮換液，Bradford法測定蛋白濃度，液氮速凍，存于-80℃?zhèn)溆?

1.4 TsCel12A酶學(xué)性質(zhì)的測定

TsCel12A酶學(xué)性質(zhì)的測定選用對(duì)硝基苯-β-D-纖維二糖苷為底物，采用終止反應(yīng)法，即反應(yīng)體系100μL，底物濃度0.25mmol/L，加入酶反應(yīng)10min后迅速置于冰上終止反應(yīng)，于400nm波長下檢測產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的吸收值，設(shè)定不加入酶的同反應(yīng)體系為空白對(duì)照組，進(jìn)行3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差.在預(yù)實(shí)驗(yàn)初步確定的95℃最適反應(yīng)溫度條件下，選取pH3.0～6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH6.0～7.5磷酸緩沖液、pH7.0～8.5 Tris-HCl緩沖液和pH8.5～11.0甘氨酸-氫氧化鈉(Gly-NaOH)緩沖液各100mmol/L，同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，測得酶的最適反應(yīng)pH.在最適的pH緩沖液中，分別于30，40，50，60，65，70，75，80，85，90，95，100℃不同溫度下進(jìn)行反應(yīng)，測定酶的最適反應(yīng)溫度.在最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH條件下，保持加入反應(yīng)的酶量不變，分別測定在0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，0.6，1.0，1.5，2.0，2.5mmol/L不同底物濃度下的反應(yīng)速率，通過擬合米氏方程計(jì)算出Km、Vmax和Kcat動(dòng)力學(xué)參數(shù).將一定量的NaCl加入pH9.0Gly-NaOH緩沖液中溶解，分別配成含5，4，3，2，1mol/L NaCl的Gly-NaOH緩沖液(pH9.0)，設(shè)置不加入NaCl的Gly-NaOH緩沖液(pH9.0)為對(duì)照組，測定TsCel12A在不同鹽濃度條件下的酶活力.

1.5 TsCel12A的結(jié)晶和X-衍射數(shù)據(jù)收集

晶體初篩采用氣相坐滴擴(kuò)散法，選取Hampton公司的Index Screen HT，Crystal Screen HT和Rigaku公司的Wizard Ⅰ～Ⅳ 4套條件，采用Intelliplate96孔板，借助Art Robbins Instruments的Gryphon結(jié)晶系統(tǒng)操作，放于20℃生長觀察.晶體優(yōu)化采用氣相懸滴擴(kuò)散法，主要調(diào)整初篩條件中的pH值(X軸梯度)和沉淀劑濃度(Y軸梯度)，放于20℃培養(yǎng)觀察，根據(jù)每一回合優(yōu)化區(qū)間中晶體的生長情況改進(jìn)下一次優(yōu)化設(shè)計(jì)中針對(duì)pH和沉淀劑濃度的調(diào)整方向及范圍，逐漸確定較適宜晶體生長的條件，獲得有利于衍射的高質(zhì)量晶體.酶與底物的共結(jié)晶，按物質(zhì)摩爾濃度比酶與底物1∶5或1∶10，在最優(yōu)的條件下共結(jié)晶生長.將用于衍射的晶體撈出于含25%甘油的防凍劑液滴后迅速放到液氮冷卻好的Puck里.X-射線衍射數(shù)據(jù)收集于上海同步輻射光源(SSRF)BL17U線站.每旋轉(zhuǎn)1°收集一張衍射圖，所得數(shù)據(jù)用HKL2000處理整合.

2 結(jié)果與討論

2.1 TsCel12A融合蛋白的純化

TsCel12A融合蛋白在E.coliBL21(DE3)菌株中表達(dá)，His-TsCel12A共有277個(gè)氨基酸殘基，理論大小約為34kDa.在重復(fù)純化的過程中，目的蛋白位置附近存在十分接近且難以分離的條帶(圖1(a)，@@@492頁）.因其酶學(xué)性質(zhì)的測定表明此酶在80℃以上的高溫環(huán)境中不發(fā)生變性，故對(duì)破碎后的菌體取得的上清增加80℃處理30min后15000r/min離心15min的操作以提高純度.將熱處理后二次離心的上清進(jìn)行鎳柱親和層析，純化得到了位置均一的洗脫樣品(圖1(b)，@@@492頁）.將樣品濃縮至5mL，經(jīng)凝膠過濾層析柱洗脫得到了單一蛋白峰(圖1(c)，@@@492頁），進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)，目的蛋白純度可達(dá)95%以上，位置較理論值偏小，原因可能為熱處理過程使其構(gòu)型更加緊密.對(duì)照凝膠過濾層析中標(biāo)準(zhǔn)品的出峰體積(圖1(d)，@@@492頁），判斷TsCel12A蛋白在溶液中以單體形式存在.進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，檢測到了第38～60位、第191～221位、第265～277位氨基酸肽段的信號(hào)(表1)，且期望值0.00017<0.01，進(jìn)一步驗(yàn)證了所獲蛋白為目的蛋白.Bradford法測定蛋白濃度約為15mg/mL.

表1 MALDI-TOF質(zhì)譜檢測到的肽段分析

(續(xù)表)

圖1 TsCel12A蛋白的純化過程分析Fig.1 Purification of TsCel12A(a) Ni-NTA親和層析SDS-PAGE膠圖.M為蛋白Marker，T為全菌樣5倍稀釋，S為菌體破碎離心后的上清，F(xiàn)T為上清流過Ni-NTA介質(zhì)后組分，50E為含有50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑的淋洗組分.1～7為緩沖液B洗脫組分(分管接收，2mL/管).樣品及Marker上樣體積均5μL.(b) Ni-NTA親和層析SDS-PAGE膠圖.HS為菌體破碎離心后上清80℃處理30min后15000r/min離心后上清.其他參數(shù)同(a).(c) 凝膠過濾層析蛋白280nm吸收峰圖.下方為SDS-PAGE檢測蛋白峰收集的組分膠圖(分管接收，1mL/管).(d) 使用標(biāo)準(zhǔn)品校正HiPrep 26/60 Sephacryl S100層析柱出峰位置所對(duì)應(yīng)蛋白大小的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.2 TsCel12A酶學(xué)性質(zhì)的研究

根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)的測定:TsCel12A為熱穩(wěn)定性酶，最適反應(yīng)溫度為95℃(圖2(a)).在低于30℃時(shí)，基本不發(fā)揮酶活力.隨著溫度的升高，活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)溫度高于85℃時(shí)酶活性保持80%以上，在95℃時(shí)達(dá)到最高的酶活力，在極高溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng).TsCel12A最適反應(yīng)pH為9.0(圖2(b))，不耐受酸性條件，pH低于6.0時(shí)基本不發(fā)揮酶活力，較適宜堿性條件，pH8.5～9.5環(huán)境下酶活性保持80%以上，在pH值相等的不同緩沖液環(huán)境，酶活性存在差異，具體表現(xiàn)為pH7.0時(shí)，TsCel12A在磷酸緩沖液中的酶活力高于Tris-HCl緩沖液；pH7.5時(shí)，在Tris-HCl緩沖液中的酶活力高于磷酸緩沖液；pH8.5時(shí)，在Gly-NaOH緩沖液中的酶活力高于Tris-HCl緩沖液.這可能是因?yàn)椴煌x子對(duì)酶活性中心存在不同的靜電作用從而影響了酶活力.根據(jù)反應(yīng)速率隨底物濃度的變化結(jié)果(圖2(c))計(jì)算出TsCel12A的Km為(0.3602±0.0343) mmol/L，Vmax為(0.1210±0.0032) mmol/(L·min)，Kcat為(4.58±0.1211) s-1.TsCel12A具備一定的耐鹽性(圖2(d))，在含1mol/L NaCl的緩沖液中相對(duì)活性為62%，在含5mol/L NaCl的緩沖液中尚未喪失酶活力，相對(duì)活性保持35%.以上結(jié)果表明在高溫、高鹽或堿性等嚴(yán)苛工業(yè)環(huán)境中，TsCel12A具備良好的應(yīng)用前景.

圖2 TsCel12A酶學(xué)性質(zhì)的研究Fig.2 Biochemical properties of TsCel12A(a) 測定TsCel12A酶促反應(yīng)的最適溫度.在100mmol/L pH9.0 Gly-NaOH緩沖液中，測定30～100℃范圍內(nèi)不同溫度對(duì)酶活力的影響.溫度為95℃時(shí)表現(xiàn)出最大酶活力，設(shè)定此溫度對(duì)應(yīng)的數(shù)值為100%.(b) 測定TsCel12A酶促反應(yīng)的最適pH.在95℃下，測定pH3～11范圍內(nèi)100mmol/L不同緩沖液對(duì)酶活力的影響.倒三角形所在曲線代表檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0～6.0)，正三角形代表磷酸緩沖液(pH 6.0～7.5)，圓形代表Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～8.5)，方形代表Gly-NaOH緩沖液(pH 8.5～11.0).在pH 9.0 Gly-NaOH緩沖液中表現(xiàn)出最大酶活力，設(shè)定此條件對(duì)應(yīng)的數(shù)值為100%.(c) 測定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線.在95℃下100mmol/L pH9.0 Gly-NaOH緩沖液中，測定不同底物濃度下的反應(yīng)速率，再根據(jù)米氏方程計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù).(d) 測定TsCel12A的耐鹽性.將不加NaCl的對(duì)照組酶活力結(jié)果設(shè)定為100%，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為存在顯著性差異(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001).

2.3 TsCel12A結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化

將純化后濃度約為15mg/mL的TsCel12A采用坐滴法在96孔板上進(jìn)行晶體初篩.20℃培養(yǎng)一周后觀察到有晶體長出，生長條件分別是Crystal ScreenHT 71: 1.6mol/L Ammoniμm sulfate，0.1mol/L MES monohydrate pH 6.5，10%(體積比)1，4-Dioxane(圖3(a)，@@@494頁）和Wizard Ⅲ & Ⅳ 49: 16%(密度)PEG 8000，40mmol/L Potassiμm phosphate dibasic，20%(體積比)Glycerol(圖3(b)，@@@494頁）.針對(duì)初篩條件晶體的優(yōu)化采用懸滴法在24孔結(jié)晶板中進(jìn)行.Crystal Screen HT 71的優(yōu)化范圍為1.6mol/L Ammoniμm sulfate，0.1mol/L MES monohydrate pH 5.2～7.1，6%～16%(體積比)1，4-Dioxane，優(yōu)化終條件為1.6mol/L Ammoniμm sulfate，0.1mol/L MES monohydrate pH 7.0，10%(體積比)1，4-Dioxane，所得晶形為平行四邊體(圖3(a)).Wizard Ⅲ & Ⅳ 49的優(yōu)化范圍為40mmol/L Potassium phosphate dibasic，10%～25%(體積比)Glycerol，10%～22%(密度)PEG 8000，優(yōu)化終條件為40mmol/L Potassiμm phosphate dibasic，26%(體積比)Glycerol，18.5%(密度)PEG 8000，所得晶形為傘形(圖3(b)).

圖3 TsCel12A蛋白晶體的生長和X-衍射情況Fig.3 Crystals and X-ray diffraction of TsCel12A(a) 從左至右依次為15mg/mL的TsCel12A在Crystal Screen HT 71初篩條件下生長的晶體圖，在其條件優(yōu)化后生長的晶體圖，用直徑為0.2mmloop環(huán)挑取的優(yōu)化終條件中用于X-射線衍射的平行四面體單晶，TsCel12A單晶在X-射線下的曝光圖(波長: 0.9793?，間距: 300.00mm).(b) 從左至右依次為15mg/mL的TsCel12A在Wizard Ⅲ & Ⅳ 49初篩條件下生長的晶體圖，在其條件優(yōu)化后生長的晶體圖.(c) 40mg/mL的TsCel12A在Crystal Screen HT 14初篩條件下生長的晶體圖.

2.4 TsCel12A晶體衍射數(shù)據(jù)的收集

撈取Crystal Screen HT 71條件中的平行四邊體單晶(135μm×90μm×10μm)，和Wizard Ⅲ & Ⅳ 49條件中的傘形晶體，于SSRF的BL17U線站衍射，均未收集到有效的衍射點(diǎn)(圖3(a)).在Crystal Screen HT 71優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上嘗試了添加劑和分別與葡萄糖、β-D-纖維二糖和對(duì)硝基苯-β-D-纖維二糖苷3種底物進(jìn)行共結(jié)晶，共結(jié)晶均為沉淀，尚未有加強(qiáng)作用.將重新純化的濃度約為40mg/mL的TsCel12A進(jìn)行結(jié)晶，篩選出Crystal Screen HT 14條件: 0.2mol/L Calcium chloride dihydrate，0.1mol/L HEPES sodium pH 7.5，28%(體積比)Polyethylene glycol 400，所得晶型為平行六面體(圖3(c))，于SSRF的BL17U線站衍射，獲得晶體數(shù)據(jù)(表2).TsCel12A蛋白晶體的分辨率2.36?，所屬空間群為P 6 2 2，晶胞參數(shù)為a=184.974，b=184.974，c=49.873，α=90°，β=90°，γ=120°.

表2 TsCel12A晶體數(shù)據(jù)

綜上所述，本文在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中成功表達(dá)純化了來源于Thermotogasp. RQ7的屬于糖苷水解酶第12家族的內(nèi)切纖維素酶TsCel12A蛋白.并根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)，測定出酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH及相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)了其極端嗜熱、耐堿和耐鹽的特性.在晶體學(xué)研究過程中通過不斷的摸索優(yōu)化，找到了有利于衍射的結(jié)晶條件，獲得了TsCel12A蛋白晶體.通過X-射線晶體衍射收集數(shù)據(jù)，解析出了TsCel12A蛋白所屬的空間群和一系列晶胞參數(shù).已報(bào)道的糖苷水解酶第12家族內(nèi)切纖維素酶的結(jié)構(gòu)多為經(jīng)典的jelly-roll折疊，由A、B兩大β-sheets構(gòu)成，其中每個(gè)β-sheet包含多個(gè)反向平行的β-strands，片層間常有α-helix進(jìn)行連接.處于內(nèi)部的β-sheet包含活性中心，形態(tài)多為裂隙，處于外部的β-sheet則更多與酶的穩(wěn)定性有關(guān)[20-22]，關(guān)于TsCel12A的結(jié)構(gòu)解析正在進(jìn)行.

同時(shí)酶與底物的共結(jié)晶條件也在進(jìn)一步摸索，希望能獲得酶催化底物進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)構(gòu)狀態(tài).除酶的野生型外，針對(duì)關(guān)鍵催化位點(diǎn)突變體的酶學(xué)性質(zhì)及晶體結(jié)構(gòu)也有待于進(jìn)一步探究.希望這些工作能最終揭示出TsCel12A蛋白水解纖維素糖鏈的具體催化機(jī)制，為更充分利用纖維素等生物能源提供新的科學(xué)依據(jù).