中國(guó)維吾爾族人群HCN1基因多態(tài)性與精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)研究

李秀麗，馬川川，陳劍華，潘 敦，賀 林，伊琦忠，師詠勇

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)系，安徽 合肥 230031; 2.Bio-X研究院，發(fā)育和神經(jīng)精神疾病 遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(教育部)和上海交通大學(xué)腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200030; 3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海市精神衛(wèi)生中心上海市精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200030; 4.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心理醫(yī)學(xué)中心，新疆烏魯木齊 830054)

精神分裂癥是一種慢性嚴(yán)重致殘的精神疾病，在全世界人群中普遍存在，終生患病率約為0.5%～1%[1].精神分裂癥給患者、親屬及整個(gè)社會(huì)帶來(lái)了極大的痛苦與沉重的負(fù)擔(dān)[2].這種疾病的臨床癥狀復(fù)雜多樣，常見(jiàn)癥狀有幻覺(jué)，妄想，溝通混亂，計(jì)劃不周，動(dòng)機(jī)減少和情緒紊亂等[3].精神分裂癥的病因迄今為止尚不明確，且病程多種多樣，發(fā)病年齡大多在16至40歲之間.雙生子、領(lǐng)養(yǎng)子和核心家系的流行病研究表明，它是一種高度遺傳性的精神疾病(遺傳率約為70%～85%)[4-6].在過(guò)去十幾年中，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)基因，這些基因在預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)、精神分裂癥藥物的研發(fā)方面顯示出獨(dú)特的臨床價(jià)值.超極化激活的環(huán)核苷酸門(mén)控(HCN)通道是一種非選擇性的電壓門(mén)控陽(yáng)離子通道，由4個(gè)編碼基因(HCN1、HCN2、HCN3、HCN4)組成，該通道在神經(jīng)元的產(chǎn)生和心臟自律性方面起著重要作用[7-8].相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)HCN通道的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[9-10].在這4種編碼基因中，HCN1基因是鉀通道亞基和大腦內(nèi)向超極化激活的電流(Ih)的主要貢獻(xiàn)者，Ih廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能，如靜息膜電位的穩(wěn)定、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性、節(jié)律活動(dòng)和突觸可塑性[11-13].隨后的研究相繼發(fā)現(xiàn)在大腦中HCN1基因是HCN通道的主要成分，且在新皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)域、小腦皮質(zhì)和腦干中高度表達(dá)[14-15].相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，HCN1在海馬區(qū)廣泛表達(dá)，對(duì)大鼠該基因敲除后，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)和記憶障礙[16].顯然，這些學(xué)習(xí)和記憶的認(rèn)知障礙都可能導(dǎo)致精神疾病.此外，一些研究發(fā)現(xiàn)HCN1蛋白可用作治療焦慮和抑郁的潛在藥物靶標(biāo)[17].更重要的是，將HCN1轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后的海馬細(xì)胞中HCN1的表達(dá)量均具有谷氨酸依賴(lài)性: 隨著谷氨酸與其受體結(jié)合，HCN1的表達(dá)量會(huì)相應(yīng)增加.隨后還發(fā)現(xiàn)HCN通道的突觸后電流Ih可抑制谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的突觸傳遞[18-19].而近年來(lái)許多研究者將突觸上的谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)以及突觸外的氨基酸能遞質(zhì)受體作為參與精神分裂癥疾病的病因?qū)W假說(shuō)進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步支持了HCN1基因可能與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)的假說(shuō)[20].在2014年，一項(xiàng)精神分裂癥全基因組關(guān)聯(lián)研究聯(lián)盟(Schizophrenia Psychiatric GWAS Consortium, PGC)在歐洲和東亞人群中新發(fā)現(xiàn)108個(gè)精神分裂癥相關(guān)的位點(diǎn)，其中HCN1基因是首次發(fā)現(xiàn)與精神分裂癥可能存在著關(guān)聯(lián)(P=5.05×10-9)[21].在2017年，我們課題組基于36180份樣本，完成了中國(guó)漢族人群全基因組關(guān)聯(lián)分析及驗(yàn)證，同時(shí)結(jié)合PGC2的歐洲樣本數(shù)據(jù)，開(kāi)展了大樣本跨種族分析以及精細(xì)定位研究，發(fā)現(xiàn)了30個(gè)新的精神分裂癥易感位點(diǎn).此項(xiàng)研究中也發(fā)現(xiàn)了歐洲人群中HCN1內(nèi)含子區(qū)域上的位點(diǎn)rs9292918，與精神分裂癥顯著相關(guān)(P=4.47×10-11)[22].這些研究強(qiáng)有力地證明了該基因可能是精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)基因.

自從2006年以來(lái)，精神疾病的GWAS已經(jīng)在歐洲和亞洲不同種群間超過(guò)10萬(wàn)個(gè)樣本進(jìn)行研究，到目前為止我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種新的疾病易感位點(diǎn)[6，21-29].之前的研究證明HCN1基因在歐洲人群中與精神分裂癥有關(guān).然而，由于潛在的遺傳異質(zhì)性，在一個(gè)群體中發(fā)現(xiàn)的遺傳變異可能在其他群體中并沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián).因此，本研究探索了中國(guó)新疆維吾爾族人群中精神分裂癥與HCN1基因之間的關(guān)系.新疆自古以來(lái)就是歐亞大陸東西方人群的融匯之地，也是古“絲綢之路”的必經(jīng)之地，在歐亞大陸人群遷徙和演化史上扮演著重要的角色，同時(shí)也造就了新疆人群的復(fù)雜多樣性[30].之前的報(bào)道認(rèn)為維吾爾族人群是漢族和西歐人群基因交流的混合結(jié)果[31].最近一項(xiàng)研究分析了涵蓋新疆全境近千例維吾爾族樣本的基因組數(shù)據(jù)，從遺傳學(xué)角度對(duì)維吾爾族的群體結(jié)構(gòu)、祖源構(gòu)成和人群融合歷史做了一個(gè)較為全面的解析，發(fā)現(xiàn)維吾爾族人口的遺傳成分主要來(lái)自歐亞大陸東、南、西、北4個(gè)方向的分化群體[32].

鑒于HCN1基因研究的現(xiàn)狀，本研究是第一次在中國(guó)維吾爾族人群探索HCN1中的常見(jiàn)變異是否會(huì)導(dǎo)致精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn).在本文中，為了研究HCN1是否在精神分裂癥中發(fā)揮重要作用，我們對(duì)985名患者和1218名正常對(duì)照中的5個(gè)位點(diǎn)rs12519313，rs10060015，rs16902112，rs16902197和rs12659024進(jìn)行了全面的基因分型，并且還分析了兩個(gè)推算的SNPs(rs1501357，rs9292918).

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究的對(duì)象是中國(guó)新疆維吾爾族人群，其中包括985例精神分裂癥患者(612例男性和373例女性，平均發(fā)病年齡為(39.45±12.12)歲)和1218例健康對(duì)照(629例男性和589例女性，平均發(fā)病年齡為(43.07±13.14)歲).精神分裂癥患者是由兩位主任級(jí)精神科醫(yī)生依據(jù)DSM-4診斷標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立診斷.正常對(duì)照是由精神科醫(yī)生通過(guò)簡(jiǎn)單的訪(fǎng)談從正常維吾爾族人群中隨機(jī)挑選，年齡和性別與患者大致相匹配，并且沒(méi)有心理健康問(wèn)題或神經(jīng)疾病史.該研究獲得了所有參與者的知情同意，并得到了當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的支持.

1.2 DNA提取、SNP的選擇和分型

基因組DNA樣本是通過(guò)Quick Gene DNA whole blood試劑盒(Fujifilm, Life Sciences Products, Tokyo, Japan)根據(jù)制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)化方案來(lái)提取.使用Nano drop ND-1000(Thermo Scientific, DE, USA)分光光度計(jì)來(lái)進(jìn)行評(píng)估基因組DNA的質(zhì)量.HCN1基因位于5號(hào)染色體上，大小為441.38bp；它由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成.標(biāo)簽SNPs的選取是通過(guò)Haploview軟件4.2版本，按照R2≥0.5和最小等位基因頻率(MAF)≥0.05的原則進(jìn)行篩選[33].對(duì)5個(gè)標(biāo)簽SNPs(rs12519313, rs10060015, rs16902112, rs16902197, rs12659024)進(jìn)行基因分型.此外，這5個(gè)標(biāo)簽SNPs和兩個(gè)推算SNPs(rs1501357，rs9292918)均位于基因的內(nèi)含子區(qū)域.7個(gè)位點(diǎn)的詳細(xì)信息位于表1中.本研究采用Mass ARRAY iPLEX Gold平臺(tái)(Sequenom Inc., San Diego, CA)對(duì)SNP進(jìn)行分型.基因分型的實(shí)驗(yàn)步驟與之前研究中所描述的常規(guī)方法相同[34].所有的樣本都有相對(duì)較高的分型結(jié)果且檢出率高于95%.

表1 HCN1基因中7個(gè)SNP的位點(diǎn)信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

我們?cè)赟HEsis軟件平臺(tái)上進(jìn)行了哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE)檢驗(yàn)、連鎖不平衡(LD)檢驗(yàn)、等位基因關(guān)聯(lián)分析、基因型關(guān)聯(lián)分析和單倍型分析(http:∥analysis.bio-x.cn/SHEsis.html)[35-36].通過(guò)擬合優(yōu)度的卡方檢驗(yàn)來(lái)測(cè)試每組中的HWE，以及病例和對(duì)照之間的等位基因和基因型分布差異.此外，使用D′和R2值去衡量連鎖不平衡程度.當(dāng)雙端P<0.05，并且在Bonferroni校正后P<0.05，結(jié)果才被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡和連鎖不平衡

表2 病例組和對(duì)照組檢出率和HWE值

我們不僅在病例組和對(duì)照組中進(jìn)行HWE檢驗(yàn)，還分析了這5個(gè)位點(diǎn)間的連鎖不平衡.HWE檢驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組中除了位點(diǎn)rs16902112的P<0.05外，其余位點(diǎn)的P值均大于0.05，故rs16902112偏離HWE，在后續(xù)的研究中舍棄該位點(diǎn).所有位點(diǎn)HWE檢驗(yàn)的詳細(xì)信息見(jiàn)表2.連鎖不平衡的結(jié)果表明在5個(gè)位點(diǎn)中，rs12519313與rs16902112、rs16902197、rs12659024, rs10060015與rs16902112，rs16902112與rs12659024，rs16902197與rs12659024之間具有強(qiáng)烈的連鎖不平衡，且位于同一個(gè)區(qū)塊內(nèi)(D′>0.95)，如圖1(a)所示.

此外，我們基于本次研究的數(shù)據(jù)和以前GWAS研究的數(shù)據(jù)來(lái)分析兩個(gè)推算的SNPs(rs9292918和rs1501357)與本研究的5個(gè)SNPs之間的連鎖不平衡.連鎖不平衡的結(jié)果見(jiàn)圖1(b)，在這些位點(diǎn)中，rs9292918與rs10060015，rs9292918與rs1501357，rs16902112與rs10060015以及rs10060015與rs1501357之間具有強(qiáng)烈的連鎖不平衡，且位于同一個(gè)區(qū)塊內(nèi).

圖1 HCN1基因上SNPs位點(diǎn)之間的連鎖不平衡Fig.1 Linkage disequilibrium among SNPs of the HCN1 gene(a) 中國(guó)維吾爾族人群HCN1基因中5個(gè)標(biāo)簽SNPs之間的連鎖不平衡.區(qū)塊中的數(shù)字是兩點(diǎn)之間的D′值.當(dāng)數(shù)值越大時(shí)，連鎖不平衡越強(qiáng).當(dāng)值越小時(shí)，連鎖不平衡越弱.(b) 基于該研究的結(jié)果和先前的GWAS結(jié)果在中國(guó)人群中，兩個(gè)推定的SNP(rs1501357，rs9292918)和5個(gè)標(biāo)簽SNP之間的連鎖不平衡.區(qū)塊中的數(shù)字是兩點(diǎn)之間的R2值.當(dāng)數(shù)值越大時(shí)，連鎖不平衡越強(qiáng).當(dāng)數(shù)值越小時(shí)，連鎖不平衡越弱.

2.2 單個(gè)位點(diǎn)和單倍型分析

5個(gè)SNPs的基因分型結(jié)果見(jiàn)表3、表4、表5、表6中.在表3中，我們未發(fā)現(xiàn)在健康對(duì)照與精神分裂癥病例之間的等位基因或基因型分布有顯著差異(在Bonferroni校正之前P>0.05).為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，我們對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行了性別分組分析.詳細(xì)的分析結(jié)果示于表4和5中，結(jié)果顯示男性和女性組之間也沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.此外，表6顯示所有位點(diǎn)在病例和對(duì)照之間的單倍型分布也沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表3 病例組和對(duì)照組中等位基因和基因型的分布

表4 男性組等位基因和基因型的分布

表5 女性組等位基因和基因型的分布

(續(xù)表)

表6 HCN1基因單倍型的分析

3 討 論

在過(guò)去的幾十年中，很多研究已經(jīng)證明HCN通道介導(dǎo)超極化激活電流(Ih)，而且在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，在調(diào)控神經(jīng)興奮和網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)方面具有顯著作用[37-38].最近研究還發(fā)現(xiàn)HCN1通道可調(diào)節(jié)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物背外側(cè)前額葉皮層(PFC)中神經(jīng)元的興奮性，而且脊柱中的HCN1通道與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)相關(guān)蛋白(DISC1: 精神分裂癥斷裂基因1，D1R: 多巴胺D1受體)共表達(dá)，這與精神分裂癥中學(xué)習(xí)記憶失調(diào)有關(guān)[39].此外，許多研究報(bào)道了HCN1通道調(diào)控許多腦認(rèn)知的生理過(guò)程，例如睡眠、學(xué)習(xí)和記憶等[12，16，40].而近年一些研究者發(fā)現(xiàn)HCN通道電流Ih與疾病癲癇發(fā)生中表達(dá)的上調(diào)，功能的增強(qiáng)有關(guān)，且突觸上的NMDA和GABAA受體以及突觸外的氨基酸能遞質(zhì)受體可能與癲癇的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[19，41].其他研究表明，在神經(jīng)系統(tǒng)中HCN通道的異常調(diào)節(jié)可能與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如心律失常，癲癇，阿爾茨海默病和神經(jīng)性疼痛，這使HCN通道成為治療探索的新目標(biāo)[11，42-45].在2014年，精神病學(xué)基因組協(xié)會(huì)-精神分裂癥工作組(PGC-SCZ)發(fā)表一項(xiàng)GWAS研究，確定了一百多個(gè)遺傳基因位點(diǎn)，并且第一次發(fā)現(xiàn)歐洲人群中HCN1基因內(nèi)含子區(qū)域上rs1501357可能是精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)[21].在2017年，我們課題組一項(xiàng)GWAS研究發(fā)現(xiàn)30個(gè)新的精神分裂癥易感位點(diǎn)，并且在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)HCN1上的rs9292918位點(diǎn)，這是繼rs1501357發(fā)現(xiàn)后的又一個(gè)與精神分裂癥可能相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)[22].這些研究都進(jìn)一步支持了本文的假說(shuō)HCN1基因可能與精神分裂癥風(fēng)險(xiǎn)有關(guān).

本文的研究旨在探索HCN1在中國(guó)維吾爾族人群中與精神分裂癥的關(guān)系，但是并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩者之間有顯著的相關(guān).接下來(lái)，我們基于之前GWAS的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行了HCN1基因上5個(gè)標(biāo)簽SNPs之間的連鎖不平衡檢驗(yàn)，和兩個(gè)推算SNPs與另外5個(gè)標(biāo)簽SNPs之間的連鎖不平衡檢驗(yàn).如圖1(a)所示，5個(gè)標(biāo)簽SNPs間存在連鎖不平衡，圖1(b)則展示了rs9292918與rs10060015, rs9292918與rs1501357, rs16902112與rs10060015以及rs10060015與rs1501357位點(diǎn)位于一個(gè)區(qū)塊內(nèi)，且存在連鎖不平衡.由于兩個(gè)推算的SNPs位點(diǎn)與另外5個(gè)標(biāo)簽位點(diǎn)都位于同一染色體上，可通過(guò)連鎖不平衡(LD)來(lái)反映同一染色體上不同基因座上等位基因的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)情況.根據(jù)LD的結(jié)果，我們可以推算出在維吾爾族人群中，這兩個(gè)推算的位點(diǎn)也可能與精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān).

我們目前的研究存在以下3方面的局限性，這些局限性可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果呈現(xiàn)出陰性.(1) 考慮到HCN1的分子大小為441.38bp，本實(shí)驗(yàn)選擇的標(biāo)簽SNPs的數(shù)量相對(duì)較少，而且這些SNP都是HCN1基因內(nèi)含子中的常見(jiàn)等位基因(MAF>0.05)，其可能不直接影響該基因的功能或表達(dá).(2) 精神分裂癥是復(fù)雜疾病且具有遺傳異質(zhì)性，新疆維吾爾族人群是一個(gè)混合的人群，有研究報(bào)道其祖先主要來(lái)自歐洲和亞洲，但具體的種群結(jié)構(gòu)仍不清楚[32].HCN1基因多態(tài)性在不同群體中有顯著差異.例如，在千人基因組(1000 genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)rs12519313-A在漢族人群(CHB)中的患病率較高(14.08%)，而歐洲人群(CEU)患病率較低(2.02%).rs10060015-G在CHB中等位基因頻率為33.98%，而在CEU中頻率為18.18%；rs16902112-C在CHB中等位基因頻率為14.56%，在CEU中頻率為0%；rs16902197-C在CHB中等位基因頻率為11.17%，在CEU中頻率為0%；rs12659024-T在CHB中等位基因頻率為13.59%，在CEU中頻率為7.58%.這些數(shù)據(jù)都表明了漢族和歐洲人群之間存在顯著的種族差異，從而解釋了該研究結(jié)論的不一致性.由于社會(huì)文化，生活習(xí)俗和環(huán)境暴露等因素的差異，漢族或歐洲人群中發(fā)現(xiàn)的精神分裂癥易感基因(CMYA5、ANK3、GRM7和親和素β3基因等)，在維吾爾族人群中并沒(méi)有得到驗(yàn)證[46-49].(3)我們根據(jù)本研究的樣本量和最小等位基因頻率(MAF)用Quanto軟件(http:∥biostats.usc.edu/Quanto.html)計(jì)算了rs12519313、rs10060015、rs16902197、rs12659024 4個(gè)位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)?zāi)芰?，具體結(jié)果見(jiàn)表7.4個(gè)位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)效力均在99%以上，證明本研究的樣本量足以得出陰性結(jié)論.我們的研究雖然表明HCN1不是中國(guó)維吾爾族人群精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)基因，但是不排除該基因可能通過(guò)與其他基因相互作用而導(dǎo)致精神分裂癥，或者可能與該病的某些內(nèi)表現(xiàn)有關(guān).盡管本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)HCN1基因與中國(guó)維吾爾族人群精神分裂癥有關(guān)聯(lián)，但是對(duì)精神分裂癥藥物基因組學(xué)后續(xù)的研究有一定的參考價(jià)值.

表7 統(tǒng)計(jì)效力的分析