缺氧誘導(dǎo)因子與胎兒生長(zhǎng)受限的相關(guān)性

黃紅麗，楊恒，姜艷華，劉曉瑛

胎兒生長(zhǎng)受限（fetus growth reception，F(xiàn)GR）的病因研究受到廣大醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重視［1-2］。有研究顯示，胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育與多種血管生成因子密切相關(guān)，其缺血缺氧狀態(tài)可能會(huì)導(dǎo)致胎盤(pán)的發(fā)育不全［3］。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）是胎盤(pán)進(jìn)行血氧調(diào)和的主要因子之一，其具有細(xì)胞增殖作用［4-5］，但有關(guān)該因子與FGR的關(guān)系還有待深入研究。本研究通過(guò)對(duì)分娩前FGR母血、分娩后臍血及胎盤(pán)中HIF-1α進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)于分娩前監(jiān)測(cè)胎盤(pán)動(dòng)脈收縮期/舒張期（systolicphase/diastolicphase，S/D）值，探討其與FGR的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

圖1 正常胎盤(pán)組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)（免疫組織化學(xué)SP法×200） 圖2 胎兒生長(zhǎng)受限胎盤(pán)組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)（免疫組織化學(xué)SP法×200）

1 資料與方法

1.1一般資料選取2017年7月至2018年7月深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院產(chǎn)檢的60例孕婦，納入標(biāo)準(zhǔn)：①單胎，②經(jīng)期正常，③無(wú)家族遺傳史，④本人或其近親屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他妊娠癥，②有心、肝、腎、血液性等嚴(yán)重性疾病，③拒不配合者。將FGR 30例為FGR組，正常妊娠30例為健康組，其中FGR組：年齡（28.69±2.68）歲，范圍為23～35歲，分娩孕周（38.25±3.12）周，范圍為35～40周，孕次（1.58±0.68）次，范圍為1～3次，體質(zhì)量指數(shù)（24.21±2.68）kg/m2，范圍為19.65～29.65 kg/m2；健康組：年齡（28.71±2.76）歲，范圍為23～36歲，分娩孕周（38.13±3.11）周，范圍為35～41周，孕次（1.51±0.65）次，范圍為1～3次，體質(zhì)量指數(shù)（24.45±2.56）kg/m2，范圍為19.65～30.12kg/m2。兩組一般資料比較差均異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（年齡：t=0.35，P=0.73；分娩孕周：t=0.41，P=0.71；孕次：t=0.52，P=0.69；體質(zhì)量指數(shù)：t=0.37，P=0.72）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2方法檢測(cè)所有孕婦孕30～32周、分娩前的母體外周血、分娩后臍血的HIF-1α水平及胎盤(pán)組織中HIF-1α的表達(dá)，并檢測(cè)孕30～32周、分娩前的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值，方法如下。

①血清及胎盤(pán)選取：所有孕婦于孕30～32周、分娩前抽取3 mL靜脈血置入無(wú)菌A試管中，胎兒順利產(chǎn)出后重復(fù)抽血操作，分離血清（3 000 r/min，10 min），冷凍存儲(chǔ)（溫度80℃）待檢，之后切取大小約為1 cm×1 cm×1 cm胎盤(pán)組織，選取依據(jù)避開(kāi)梗死、出血、鈣化灶原則。

②血清檢測(cè)：采取酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HIF-1α水平；采取免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)胎盤(pán)組織中HIF-1α的表達(dá)，將所有胎盤(pán)組織經(jīng)10%甲醛固定和石蠟，包埋后，連續(xù)切片進(jìn)行脫蠟，切片厚度均為4 μm，之后由高濃度到低濃度乙醇（95%乙醇2 min→95%乙醇2 min→70%乙醇1 min→蒸餾水1 min→蒸餾水1 min）進(jìn)行水化，給予檸檬酸（pH 6.0）高壓熱修復(fù)：噴氣2 min，冷卻后用蒸餾水清洗，描線上機(jī)（PBS預(yù)洗一次→3%過(guò)氧化氫10 min→PBS緩沖液沖洗1次→一抗孵育60 min→PBS緩沖液沖洗1次→二抗孵育15 min→PBS緩沖液沖洗2次→DAB顯色4 min→蒸餾水沖洗2次），最后用蘇木素快速染水中返藍(lán)，吹干封片，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，所有試劑盒均購(gòu)自廣州易錦生物技術(shù)有限公司。

③胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值：采取多普勒超聲診斷儀對(duì)孕婦胎盤(pán)血流動(dòng)力學(xué)情況進(jìn)行彩色多普勒血流顯像（CDFI）監(jiān)測(cè)，從胎盤(pán)根部與臍動(dòng)脈對(duì)應(yīng)的小動(dòng)脈開(kāi)始采集，頻率為4MHz，確保血流波采集線平行于靶動(dòng)脈血管方向，且聲束與血流夾角＜15°，波形穩(wěn)定后停幀，分析測(cè)得S/D。每次樣至少獲取5個(gè)以上波形，每次測(cè)定3次，取平均值。

1.3指標(biāo)觀察和標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)分析所有孕婦孕30～32周、分娩前的母體外周血、分娩后臍血的HIF-1α水平及胎盤(pán)組織中HIF-1α的表達(dá)，并檢測(cè)孕30～32周、分娩前的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值，其中HIF-1α表達(dá)應(yīng)在高倍視野（×200倍），按隨機(jī)數(shù)字表法選擇5個(gè)視野觀察，根據(jù)SP法染色以細(xì)胞漿中出現(xiàn)變異性染色的深淺進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性強(qiáng)度以無(wú)色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分；棕黃色為3分。根據(jù)組織染色細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性（0分）；5%～25%（1分）；26%～50%（2分）；51%～75%（3分）；＞75%（4分）。兩者評(píng)分相乘，0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），方便試驗(yàn)操作和分析，用（-）代表陰性，（+）（++）（+++）代表陽(yáng)性，陽(yáng)性代表高表達(dá)［6-7］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料（符合正態(tài)分布）以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩變量關(guān)聯(lián)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組各孕周母體外周血、臍血的HIF-1α水平比較FGR組孕婦孕30～32周、分娩前的母體外周血，分娩后臍血的HIF-1α水平明顯高于健康組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 胎兒生長(zhǎng)受限（FGR）組和胎兒健康組各孕周母體外周血、分娩后臍血的HIF-1α水平比較/（pg/L，±s）

表1 胎兒生長(zhǎng)受限（FGR）組和胎兒健康組各孕周母體外周血、分娩后臍血的HIF-1α水平比較/（pg/L，±s）

組別健康組FGR組t值P值例數(shù)30 30孕30～32周48.23±4.65 118.36±12.21 29.399＜0.001分娩前47.69±4.38 119.25±12.31 29.998＜0.001分娩后臍血48.11±4.85 120.08±13.12 28.182＜0.001

2.2兩組分娩后胎盤(pán)組織中HIF-1α的表達(dá)比較FGR組孕婦分娩后胎盤(pán)組織中HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)43.33%（13/30）明顯高于健康組6.67%（2/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.756，P=0.001），見(jiàn)圖1，2。

2.3兩組同孕周的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值比較FGR組孕婦孕30～32周、分娩前的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值明顯高于健康組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 胎兒生長(zhǎng)受限（FGR）組和胎兒健康組同孕周的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值比較/±s

表2 胎兒生長(zhǎng)受限（FGR）組和胎兒健康組同孕周的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值比較/±s

組別健康組FGR組t值P值例數(shù)30 30孕30～32周2.41±0.29 3.51±0.48 10.743 0.000分娩前1.98±0.23 3.35±0.54 12.785 0.000

2.4分娩前母血HIF-1α水平與分娩后胎盤(pán)HIF-1α表達(dá)的Pearson相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析顯示，分娩前母血HIF-1α與分娩后胎盤(pán)HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.615，P=0.005）。

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)生育政策改變，F(xiàn)GR發(fā)病率日益上升，因此如何降低FGR的發(fā)生具有重要的臨床價(jià)值［8-9］。

有研究顯示，從受精卵開(kāi)始植入子宮內(nèi)膜至胎兒足月分娩的整個(gè)妊娠過(guò)程中，胎盤(pán)的氧濃度在每個(gè)妊娠階段都在發(fā)生變化，這種氧濃度變化構(gòu)成了胎盤(pán)發(fā)育的必要條件，提示胎盤(pán)成長(zhǎng)可能與其血氧供應(yīng)密切相關(guān)［10］。文獻(xiàn)報(bào)道，HIF-1α是臨床常見(jiàn)的血氧調(diào)節(jié)指標(biāo)，可有效改善細(xì)胞的發(fā)育及機(jī)體的免疫功能，尤其在細(xì)胞低氧應(yīng)答機(jī)制中扮演重要角色，當(dāng)細(xì)胞處于持續(xù)缺氧狀態(tài)時(shí)，其水平會(huì)發(fā)生異常變化［11］。此外，胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值是反映血管的血流變化，其與胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)［12］。

對(duì)此，本研究通過(guò)檢測(cè)所有孕婦的HIF-1α及胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGR組孕婦孕30～32周、分娩前的母體外周血、分娩后臍血的HIF-1α水平明顯高于健康組，F(xiàn)GR組孕婦分娩后胎盤(pán)組織中HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于健康組。蔣玲玲等［13］學(xué)者的研究結(jié)果也提示HIF-1α的變化與FGR的發(fā)生有關(guān)，本研究與此基本一致。說(shuō)明FGR孕婦在不同孕周期均出現(xiàn)高水平HIF-1α表達(dá)，進(jìn)一步提示FGR存在持續(xù)性缺氧狀態(tài)。這可能是正常的胚胎發(fā)育是在缺氧的環(huán)境中進(jìn)行，此環(huán)境有利于毛細(xì)血管的形成，且隨著胚胎逐漸成形，血管內(nèi)皮細(xì)胞向外擴(kuò)散，并加大血管，提高血液流動(dòng)和滲透能力，進(jìn)一步波及蛻膜組織，增加新生血管，而此時(shí)子宮胎盤(pán)動(dòng)脈循環(huán)建立，胚胎擺脫缺氧環(huán)境，母體通過(guò)動(dòng)脈循環(huán)源源不斷往胎兒注入高氧物質(zhì)，保障胎兒正常發(fā)育，HIF-1α水平恢復(fù)正常。而當(dāng)孕婦出現(xiàn)FGR疾病時(shí)，胚胎的發(fā)育可能因絨毛小動(dòng)脈水腫、痙攣、閉塞等因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)法向外擴(kuò)張，繼而影響及蛻膜組織正常功能，最終導(dǎo)致胎盤(pán)血流灌注變小，無(wú)法增加新生血管，使宮內(nèi)缺氧環(huán)境持續(xù)保持，影響胎兒生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)FGR組孕婦孕30～32周、分娩后的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值明顯高于健康組，表明FGR孕婦在不同孕周期的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值存在異常，進(jìn)一步提示此時(shí)胎兒可能存在供血不暢狀態(tài)。究其原因可能是當(dāng)胎兒發(fā)育不良時(shí)，胎盤(pán)的生長(zhǎng)和發(fā)育受到阻滯，導(dǎo)致胎盤(pán)的血管不暢，營(yíng)養(yǎng)無(wú)法正常供應(yīng)，從而影響血流阻力和血流速度，最終造成血流比值降低幅度變緩［13-14］。故檢測(cè)孕婦的胎盤(pán)動(dòng)脈S/D可預(yù)測(cè)胎兒的發(fā)育狀態(tài)。此外，Pearson相關(guān)性分析顯示，分娩前母血HIF-1α與分娩后胎盤(pán)HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），提示臨床醫(yī)生可在FGR孕婦產(chǎn)檢時(shí)定期檢測(cè)血清HIF-lα水平以評(píng)估胎兒的發(fā)育情況。若其水平變化異常，可結(jié)合胎兒胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值來(lái)指導(dǎo)產(chǎn)科醫(yī)生處理FGR［15］。

綜上所述，母血中HIF-1α水平、胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值可間接評(píng)估FGR孕婦胎盤(pán)功能狀態(tài)或胎兒宮內(nèi)狀況。孕期可通過(guò)監(jiān)測(cè)孕婦血清HIF-1α的水平、胎盤(pán)動(dòng)脈S/D值來(lái)指導(dǎo)產(chǎn)科醫(yī)生處理FGR。（本文圖1，2見(jiàn)插圖10-4）