半枝蓮總黃酮對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及遷移的影響

任守雷，郭曉曉，陳翠翠，趙海燕，李來(lái)慶

半枝蓮（Scutellɑriɑ bɑrbɑtɑ D.Don，SB）屬于唇形科植物，性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，是中醫(yī)處方和成藥中的常用中藥，其主要有散瘀止痛、涼血解毒、清熱利濕和消腫之功效；主要有效成分為黃酮類(lèi)、生物堿、鞣質(zhì)和甾體類(lèi)等化合物，具有抗腫瘤作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及遷移，改善腫瘤細(xì)胞耐藥性［1-3］。針對(duì)其作用機(jī)制的研究表明，半枝蓮提取物可通過(guò)抑制PI3K和TGF-β信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲［4-5］；也可通過(guò)下調(diào)Treg細(xì)胞控制Th1/Th17型免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)［6］。

肺癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，致死率較高，其中非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要發(fā)病類(lèi)型，約占肺癌發(fā)病率的80%，非小細(xì)胞肺癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌3種類(lèi)型［7-9］。人肺腺癌A549細(xì)胞常用于肺癌模型制備，本研究于2017年10月至2018年2月通過(guò)觀察半枝蓮總黃酮提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，探討半枝蓮總黃酮對(duì)于肺癌治療方面的機(jī)制，為半枝蓮總黃酮在肺癌方面的治療提供參考。

圖1 半枝蓮總黃酮誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡情況：A、B分別為陰性、陽(yáng)性對(duì)照組；C、D、E、F、G分別為實(shí)驗(yàn)組1，5，10，20，40 μg/mL

1 材料與方法

1.1材料與儀器胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；半枝蓮，購(gòu)自太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司；蘆丁對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；抗凋亡抑制蛋白Survivin抗體、抗促凋亡蛋白酶Caspase-3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自博士德公司；細(xì)胞培養(yǎng)6孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；磷脂結(jié)合蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexinv-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)凱基公司；粵顯1400602型倒置顯微鏡；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（MCO175，SANYO）；多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（盧湘儀，TDZ5-WS，上海）；多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司，EnSpire，美國(guó)）；流式細(xì)胞檢測(cè)儀（Millipore公司，Guava easyCyte?8HT，美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1半枝蓮總黃酮提取液制備 稱(chēng)取適量半枝蓮，甲醇溶解，制取總黃酮粗提液；取定量蘆丁溶于甲醇，制備對(duì)照品。依次配置蘆丁對(duì)照品，濃度分別為0.24 mg/mL、0.48 mg/mL、0.72 mg/mL、0.96 mg/mL、1.2 mg/mL，以甲醇為空白對(duì)照，測(cè)定500 nm下樣品吸光度，測(cè)定半枝蓮總黃酮粗提取液濃度［12］。1.2.2半枝蓮總黃酮處理A549細(xì)胞 將A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，計(jì)數(shù)，鋪96孔板，每孔鋪板3×103個(gè)/100 μL，5%二氧化碳，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。調(diào)整半枝蓮總黃酮溶液濃度為1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL，每孔加200 μL，作為實(shí)驗(yàn)組。陰性對(duì)照組加200 μL1640培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加入200 μL 40 μg/mL蘆丁溶液。每組做5個(gè)復(fù)孔。

A549細(xì)胞鋪板，5%二氧化碳，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩溶解藍(lán)色結(jié)晶物。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm光吸收值（OD值），按照以下公式計(jì)算增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù) 將A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/毫升，每孔2 mL，鋪板6孔板，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，其他處理方式同1.2.2。5%二氧化碳，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌，胰酶消化，終止消化后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS緩沖液重懸計(jì)數(shù)；取1×105個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，100 μL 1×Annexin V buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，混勻。室溫避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)（Annexin V-FITC綠色熒光，PI紅色熒光）。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)Survivin，Caspase-3蛋白的表達(dá) 將A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/毫升，每孔2 mL，鋪板6孔板，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，其他處理方式同1.2.2。5%二氧化碳，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。消化收集細(xì)胞，裂解，12 000 r/min離心5 min，取上清，BCA定量；加入5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，100℃沸水浴5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），上樣量為20 μg。濃縮膠60 V，20 min；分離膠120 V，60 min電泳。100 V，60 min轉(zhuǎn)膜；5%牛血清白蛋白（BSA）封閉60 min，一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜；二抗室溫孵育1 h，洗膜；ECL發(fā)光液室溫孵育5 min，于暗室醫(yī)用X光底片曝光1 min后，依次顯影、定影。

1.2.5細(xì)胞遷移 將A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，每孔2 mL，鋪板6孔板，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，37℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)24 h至細(xì)胞基本鋪滿(mǎn)板孔。用槍頭在板孔內(nèi)做垂直劃痕，PBS緩沖液洗滌，加入終濃度為1，5，10，20，40 μg/mL的半枝蓮總黃酮1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，倒置相差顯微鏡觀察。每個(gè)視野內(nèi)，抽簽法選擇3個(gè)區(qū)域，并計(jì)算100×視野內(nèi)遷移劃痕空隙的像素。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MTT檢測(cè)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖情況經(jīng)不同處理后，陽(yáng)性對(duì)照組增殖抑制率為（57.234±0.533）%，實(shí)驗(yàn)組1，5，10，20，40 μg/mL半枝蓮總黃酮處理增殖抑制率分別為（14.852±1.059）%、（23.486±1.366）%、（36.396±0.321）% 、（46.179±1.334）%和（51.530±1.054）%。半枝蓮總黃酮抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，隨濃度增加抑制率顯著升高，呈濃度依賴(lài)（F=1 408.303，P＜0.001）。推測(cè)半枝蓮總黃酮可抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖，且其抑制作用強(qiáng)弱與半枝蓮總黃酮濃度有關(guān)。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞凋亡情況，陰性對(duì)照組凋亡率為（9.09±0.50）%；實(shí)驗(yàn)組1，5，10，20，40 μg/mL半枝蓮總黃酮處理凋亡率分別為（24.62±0.70）%、（34.67±0.46）%、（46.92±0.29）%、（55.67±0.57）%和（59.29±0.73）%；陽(yáng)性對(duì)照組凋亡率為（67.27±1.48）%。與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組凋亡率增加（F=1 467.681，均P＜0.001）。隨半枝蓮總黃酮濃度增加凋亡率顯著增加，結(jié)果顯示，半枝蓮總黃酮誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1。

2.3Western Blot檢測(cè)Caspase-3、Survivin蛋白表達(dá)情況與陰性對(duì)照組（0.44±0.05）和陽(yáng)性對(duì)照組（1.56±0.24）相比，半枝蓮總黃酮處理人肺腺癌A549細(xì)胞，Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)逐漸升高［分別為（0.75±0.08，（0.87±0.03），（0.90±0.07），（0.98±0.06）和（1.23±0.07）］（F=34.176，P＜0.001）。與陰性對(duì)照組（1.46±0.06）和陽(yáng)性對(duì)照組（0.45±0.06）相比，Survivin凋亡抑制蛋白表達(dá)逐漸下降［分別為（1.21±0.12），（0.86±0.06），（0.80±0.06），（0.71±0.09）和（0.54±0.10）］（F=57.730，P＜0.001）。半枝蓮總黃酮通過(guò)上調(diào)Caspase-3表達(dá)和下調(diào)Survivin表達(dá)，誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖2。

圖2 半枝蓮總黃酮處理人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞遷移情況細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組（707.6±92.6）像素和陽(yáng)性對(duì)照組（209.6±41.7）像素相比，不同濃度半枝蓮總黃酮處理組細(xì)胞遷移情況明顯不同［分別為（594.0±26.7）像素，（410.0±44.0）像素，（359.3±38.8）像素，（307.0±54.3）像素和（285.3±44.0）像素］（F=34.612，P＜0.001）。半枝蓮總黃酮濃度升高可導(dǎo)致細(xì)胞遷移速度降低，推測(cè)半枝蓮總黃酮能夠抑制人肺腺癌A549細(xì)胞遷移，并呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖3。

3 討論

半枝蓮又稱(chēng)并頭草、金挖耳、牙刷草、狹葉韓信草。最早記載于《外科正宗》一書(shū)，具化瘀、清熱、解毒等功效，臨床上應(yīng)用具有抑菌、抗病毒、解熱、保肝、抗腫瘤、抗癌等作用，被現(xiàn)代中藥醫(yī)師青睞。近年來(lái)，臨床研究者對(duì)半枝蓮藥效、化學(xué)成分等的研究大幅度增多，為其在臨床應(yīng)用提供極大幫助。有研究證實(shí)，植物提取物中的某些黃酮類(lèi)和生物堿類(lèi)化合物具有明顯的抗腫瘤作用，作用的機(jī)制是在一定程度上誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、遷移以及侵襲［4］。本研究的MTT實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的半枝蓮總黃酮對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞具有不同程度的抑制，且這種抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，顯示出一定的劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度的半枝蓮提取物可誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，且細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加而提高，這提示半枝蓮總黃酮抑制A549細(xì)胞增殖的機(jī)制在于誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

圖3 半枝蓮總黃酮對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞遷移的影響：A、B分別為陰性、陽(yáng)性對(duì)照組；C、D、E、F、G分別為實(shí)驗(yàn)組1，5，10，20，40 μg/mL

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）的新成員，參與促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞有絲分裂和血管生成等。Survivin具有腫瘤特異性，抵抗細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［10］。Gu等［11］研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇可下調(diào)Survivin的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Hela細(xì)胞凋亡，同時(shí)減緩其增殖速率；Survivin的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域BIR和C螺旋可精確調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞凋亡以及自噬，可作為腫瘤靶向藥物研發(fā)對(duì)象，提高靶向藥物的準(zhǔn)確性及有效性［12］；在83%的子宮內(nèi)膜癌中，Survivin表達(dá)量上調(diào)，細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)［13］；靶向干擾食管癌Eca-109細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)，可曾慶人食管癌Eca-109細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶的化療敏感性，利于提高化療療效［14］；儲(chǔ)進(jìn)錦等通過(guò)紫外照射人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)輻射可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞COX-2和Survivin蛋白表達(dá)量增加，這可能是膠質(zhì)瘤存在放射抵抗的機(jī)制之一［15］。Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，可以被多種因素活化，既可被factor associated suicide/factor associated suicide ligand（Fas/FasL，自殺相關(guān)因子及其配體）途徑活化，也可以通過(guò)顆粒酶B途徑活化，活化后的Caspase-3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，Survivin表達(dá)量與Caspase-3表達(dá)量具有負(fù)相關(guān)性，推測(cè)Survivin通過(guò)抑制Caspase-3表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡［2，16］。

本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果表明半枝蓮總黃酮可下調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)水平和上調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，且其調(diào)控具有劑量依賴(lài)性。因而，半枝蓮總黃酮通過(guò)下調(diào)A549細(xì)胞的Survivin蛋白表達(dá)，減弱Survivin對(duì)細(xì)胞凋亡因子Caspase-3活性抑制作用，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，最終抑制A549細(xì)胞的增殖。

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性之一，是腫瘤病人死亡的主要原因，亦是腫瘤切除預(yù)后不良的原因［17］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床腫瘤病人約有80%～90%死于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［18］。本研究通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，半枝蓮總黃酮可抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的遷移，且其作用隨藥物濃度增加而增強(qiáng)，呈一定的劑量依賴(lài)性。

綜上所述，半枝蓮總黃酮可抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，可能與Survivin蛋白降低或caspase 3蛋白表達(dá)量升高有關(guān)；另外，半枝蓮總黃酮可抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的遷移。

（本文圖1見(jiàn)插圖10-2）