血糖及糖化血紅蛋白的檢測及干擾研究進(jìn)展

李亮亮 王偉靈 趙誠 尹元

摘要：2010年美國糖尿病協(xié)會將糖化血紅蛋白（HbA1c）檢測作為篩選和診斷糖尿病指標(biāo)，其參考界值為HbA1c≥6.5%。至此，HbA1c同血糖一樣正式成為糖尿病診斷檢測指標(biāo)。血糖及HbA1c作為杰出的糖尿病診療指標(biāo)，其檢驗方法靈活多變且較易受外界多種因素影響，干擾檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著檢驗技術(shù)的進(jìn)步，臨床與糖尿病診療相關(guān)的生物傳感器的應(yīng)用逐漸廣泛，本文將針對二者常見檢測方法的干擾因素做一綜述。

關(guān)鍵詞：糖尿病;血糖;糖化血紅蛋白

中圖分類號：R587.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.05.015

文章編號：1006-1959（2019）05-0043-05

Abstract：In 2010， the American Diabetes Association used glycosylated hemoglobin （HbA1c） as a screening and diagnostic diabetes indicator with a reference margin of HbA1c ≥ 6.5%. At this point， HbA1c has officially become a diagnostic indicator for diabetes， just like blood sugar. Blood glucose and HbA1c are excellent indicators for diagnosis and treatment of diabetes. The test methods are flexible and changeable， and are more susceptible to various external factors， which interferes with the accuracy of test results. With the advancement of testing technology， the application of biosensors related to clinical diagnosis and treatment of diabetes has become more and more extensive. This paper will review the interference factors of common detection methods.

Key words：Diabetes;Blood sugar;Glycated hemoglobin

糖尿?。╠iabete）是以高血糖為主要特征的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]，研究表明其發(fā)病率逐年升高，我國糖尿病發(fā)病率已從1980年的0.67%升至2013年的10.4%，至2017年我國20歲以上糖尿病患者已高達(dá)1.144億，每年因糖尿病導(dǎo)致的死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的80%，占我國總疾病負(fù)擔(dān)的70%[2，3]。國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）統(tǒng)計結(jié)果顯示，預(yù)計2045年全球糖尿病患者可達(dá)6.29億[4]。血糖HbA1c作為糖尿病診療的重要參考指標(biāo)，有重要的臨床意義。血糖可反映人血清中的糖含量，多數(shù)為血清中葡萄糖的含量。HbA1c作為人體血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，則可反映受試者近8～12周的血糖情況。而由于血糖具有較大波動性，HbA1c截值敏感性因種族、年齡以及不同衛(wèi)生系統(tǒng)中選擇的檢測方法的不同而有所區(qū)別，導(dǎo)致不同國家對血糖和HbA1c的控制和治療目標(biāo)仍存在些許差異。自2011年WHO建議取HbA1c≥6.5%為糖尿病診斷的另一切點，為推動糖尿病的規(guī)范化診治，美國糖尿病學(xué)會（American Diabetes Association，ADA）、中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會（Chinese Diabetes Society，CDS）基于糖尿病患病人群的循證證據(jù)，以及臨床應(yīng)用的適用性和實用價值，依據(jù)最新研究證據(jù)經(jīng)過數(shù)次修訂，更加明確了血糖及HbA1c在糖尿病診斷及治療路徑及治療藥物選取中的重要作用[5]。中國CDS指出，國內(nèi)一些研究認(rèn)為中國成人HbA1c診斷最佳切點應(yīng)為6.2%～6.4%，其中以6.3%的依據(jù)最多[6]。在這種情況下，臨床檢驗的準(zhǔn)確性顯得愈發(fā)重要，因此，了解臨床血糖、HbA1c干擾的產(chǎn)生方式及其可能帶來的不利影響，對協(xié)助臨床診療、降低患者損傷顯得尤為重要。

1檢驗方法

臨床檢測系統(tǒng)分為中心實驗室（central laboratory，CL）和即時檢測系統(tǒng)（point-of-care testing，POCT）。血糖的測定包含空腹血糖和隨機(jī)血糖測定，依據(jù)臨床需求的改變，可選取不同檢測系統(tǒng)進(jìn)行血糖監(jiān)測。酶法是中心實驗室主要的監(jiān)測方法，該法的特異度和敏感度均較高，主要包括己糖激酶（hexokinase，HK）法、葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）法和葡萄糖脫氫酶（Glucose dehydrogenase，GDH）法。POCT多使用電化學(xué)方法測定血葡萄糖含量，目前臨床使用的血糖儀的檢測技術(shù)均采用生物酶法，主要有GOD和GDH兩種，而GDH 還需聯(lián)用不同輔酶，分別為吡咯喹啉醌葡萄糖脫氫酶（Pyrroquinolinquinone glucose dehydrogenase，PQQ-GDH）、黃素腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脫氫酶（flavin adenine dinucleotideglucose dehydrogenase，F(xiàn)AD-GDH）及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脫氫酶（Nicotinamide adenine dinucleotide glucose dehydrogenase，NAD-GDH）三種。但其各有缺陷，臨床使用需結(jié)合患者情況選用不同的血糖儀，如GDH血糖儀易受糖類物質(zhì)干擾，而GOD 血糖儀對葡萄糖特異性較高，但易受氧分壓的干擾[7]。

GHb是指由血紅蛋白（Hb）和葡萄糖通過非酶作用形成的一種Hb產(chǎn)物，健康人Hb可分為HbA（成人Hb 97%）、HbA2（2.5%）和HbF（胎兒Hb 0.5%）三類。大多數(shù)HbA未被糖化（大約94%），大約6%的HbA中1條或2條β-鏈氨基酸末端與葡萄糖形成的穩(wěn)定、不可逆的四聚體化合物（N-1-脫氧果糖基-Hb），可被歸類為HbA1c[8]。臨床實驗室常用的HbA1c分析方法分為兩大類：一類基于所帶電荷不同，包括陽離子交換層析法、電泳法和高效液相色普法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）等;另一類基于GHb基團(tuán)結(jié)構(gòu)不同，包括親和層析法和免疫法等。其中HPLC法又可細(xì)分為離子交換-高效液相色譜法（Ion Exchange-High Performance Liquid Chromatography，IE-HPLC）和親和層析-高效液相色譜（Affinity chromatography-High Performance Liquid Chromatography，AC-HPLC），前者被認(rèn)為是HbA1c檢測的國際標(biāo)準(zhǔn)化方法[9]。AC-HPLC系統(tǒng)工作原理是葡萄糖和血紅蛋白穩(wěn)定結(jié)合后都會產(chǎn)生順位二醇官能團(tuán)，后者能與硼酸鹽特異性結(jié)合，進(jìn)而分離測定HbA1c。IE-HPLC系統(tǒng)工作原理是利用HbA1c與其他Hb電荷的不同分離HbA1c。

2干擾血糖及HbA1c測定的因素

2.1干擾血糖測定的因素

2.1.1藥物對血糖的干擾? 在臨床中，同一檢驗項目常存在不同的檢驗方法，不同檢驗方法之間的對比也有助于臨床對檢驗錯誤及干擾的發(fā)現(xiàn)。血糖常用方法有HK法、氧化酶偶聯(lián)比色（GOD-POD）法、氧化酶電極法（GOD-OR），其中GOD-OR法屬于床邊快速檢測系統(tǒng)，方便快捷。張力等[10]、周競[11]等研究表明，血必凈可對己糖激酶法有負(fù)干擾，多巴胺、復(fù)方丹參、維生素C（VitC）對GOD-POD法存在負(fù)干擾而對GOD-OR法無干擾。但國外學(xué)者研究表明[12，13]，VitC在燒傷患者中大量使用可對GOD-OR法產(chǎn)生正干擾，影響血糖檢測準(zhǔn)確性，造成低血糖的發(fā)生。因此，掌握藥物對不同檢驗方法產(chǎn)生的干擾，對于解決臨床誤診誤治及醫(yī)療糾紛有極大的幫助。

2.1.2其他? 血糖本身易受多種因素影響發(fā)生變化，如檢驗前標(biāo)本處理延時、血細(xì)胞比容改變等均可影響血糖測量[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15]，血液標(biāo)本離體后能否及時處理亦可影響血葡萄糖的濃度，血糖會以每小時7%的速率進(jìn)行降解，即使加入氟化鈉抑制葡萄糖酵解酶實現(xiàn)糖酵解抑制，也需要2 h才能開始起效，而分離提取后無溶血的血清，血糖可在25℃以下穩(wěn)定保存8 h，當(dāng)溫度達(dá)4℃以下時，可保存72 h。血液粘度的增加可減緩血液中不同組分的擴(kuò)散，可降低安培傳感器中的電流[16]。溶血會使細(xì)胞內(nèi)容物釋放，導(dǎo)致Hb濃度增高，Hb在主波長340 nm處有明顯的吸收峰，可對HK法測定Glu產(chǎn)生正干擾[17]。

此外，雖然實驗室分析是評估血糖水平較為準(zhǔn)確的檢測方法，但由于成本和時間延遲，POCT的臨床應(yīng)用更為廣泛。但由于所用酶的不同，技術(shù)方法或測試條的結(jié)構(gòu)不同，?？僧a(chǎn)生不同干擾。FAD-GDH和NAD-GDH原理的血糖儀不能區(qū)分木糖與葡萄糖，PQQ-GDH原理的血糖儀不能區(qū)分麥芽糖、半乳糖等糖類物質(zhì)與葡萄糖，以艾考糊精作為滲透劑進(jìn)行腹膜透析的患者使用基于GDH-PQQ的方法可對血糖檢測形成明顯的正干擾，導(dǎo)致低血糖的漏診，然而經(jīng)突變改良的Mut.Q-GDH原理的血糖儀可不受麥芽糖、木糖等糖類物質(zhì)干擾[18]。

2.2干擾HbA1c測定的因素

2.2.1藥物對HbA1c的干擾? HbA1c的生成反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，但其反應(yīng)初期形成的L-A1c（labile-A1c）具有不穩(wěn)定性，數(shù)小時后可與血糖濃度達(dá)到平衡，經(jīng)Amadori重排形成早期穩(wěn)定的糖化產(chǎn)物，并與血糖濃度成正比，可反映患者近8～12周的血糖控制情況[19]。由于其初期的不穩(wěn)定性使其可受到一定影響，維生素C和維生素E可以抑制Hb的糖基化，從而使HbA1c結(jié)果偏低。另有研究表明[20]，長期服用阿司匹林超過1個月者，對毛細(xì)管電泳法檢測HbA1c存在正干擾。

2.2.2 Hb變異體? Hb由四條珠蛋白鏈（兩條α鏈和兩條β鏈）組成的復(fù)合變構(gòu)蛋白。HbF在出生時占較大優(yōu)勢，由兩條α鏈和兩條γ鏈組成。由于先天性球蛋白鏈合成失調(diào)而存在的HbA1c變體，稱為“血紅蛋白病”，部分可直接干擾HbA1c的檢測，世界范圍內(nèi)最常見的Hb變異體依次為HbS、HbE、HbC和HbD，我國最常見的異常血紅蛋白為HbG、HbD、HbQ、HbJ和HbE[21]。Hb變異體純合子患者，紅細(xì)胞功能形態(tài)多嚴(yán)重受損，使紅細(xì)胞壽命明顯縮短，如HbS純合子導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞性貧血，而Hb變異體雜合子的受試者通常是無癥狀的，并且紅細(xì)胞存活率正常。所有這些Hb變異體在β鏈中都有單個氨基酸被取代，多項研究表明[22-25]，Hb變異體可對不同HbA1c的檢測方法長生干擾，如：HbJ可對兩種不同的HPLC法均產(chǎn)生負(fù)干擾;HbF對免疫比濁法、IE-HPLC法產(chǎn)生負(fù)干擾，同時亦可對毛細(xì)管電泳法產(chǎn)生正干擾;當(dāng)使用AC-HPLC法檢測HbA1c時，HbS對其產(chǎn)生正向干擾，HbE則產(chǎn)生負(fù)向干擾。因此，ADA不建議在血紅蛋白變異體存在的情況下使用HbA1c作為糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[26]。

Hb變異體均有一條蛋白鏈的末端殘基氨基酸被其他氨基酸取代，進(jìn)而影響Hb結(jié)構(gòu)、電荷發(fā)生變化或形成化學(xué)修飾衍生物，從而干擾HbA1c白檢測。Hb變異體Hb Raleigh β鏈末端的纈氨酸（Val）被丙氨酸（Ala）取代，形成大量乙?；绊慔b糖化的形成干擾檢測結(jié)果。約60%HbA的糖化發(fā)生在β鏈的氨基末端纈氨酸殘基上，而HbF具有兩條γ鏈，β鏈被γ鏈取代，其末端殘基是甘氨酸糖化速率較慢，最終均導(dǎo)致硼酸酯親和法測得的HbA1c值假性降低。HbJ在β鏈的密碼子56處發(fā)生突變，導(dǎo)致甘氨酸（Gly）被天冬氨酸（Asp）取代，研究發(fā)現(xiàn)HbA1c濃度為6%和9%時均可對HbJ親和層析液相色譜法產(chǎn)生負(fù)干擾，說明HbJ對親和層析液相色譜法有臨床顯著的干擾[27]?？傊?，無論何種原因，多數(shù)Hb變異體均會干擾HbA1c檢測方法，故同其他實驗室檢查一樣，任何不符合臨床情況的結(jié)果都應(yīng)與臨床結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)查做出合理的解釋及診斷。