耐熱木聚糖酶菌株的篩選鑒定及發(fā)酵條件分析

楊 然，張笑雨，劉朋肖，范光森，李秀婷*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心（北京工商大學(xué)），北京 100048；2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；3.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

作為一種高效、綠色、安全的半纖維素水解酶，木聚糖酶在食品焙烤及添加劑[1]、飼料工業(yè)[2]、助漂紡織[3]以及能源轉(zhuǎn)化方面[4]一直得到良好的開發(fā)與應(yīng)用。如今，現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境對(duì)木聚糖酶特性的要求越來越嚴(yán)苛，從環(huán)境中篩選具有不同特性的木聚糖酶成為解決工業(yè)生產(chǎn)需求的途徑之一[5]。耐熱木聚糖酶作為一類可在高溫環(huán)境下對(duì)半纖維素進(jìn)行特性降解的水解酶，其應(yīng)用前景廣闊且市場(chǎng)需求強(qiáng)烈。目前，利用傳統(tǒng)篩選技術(shù)已獲得來源于細(xì)菌、真菌等耐熱木聚糖酶并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。張曉元等[6]從土壤樣品中篩選獲得1 株芽孢桿菌，該菌可利用玉米芯發(fā)酵生產(chǎn)耐熱木聚糖酶，酶活力高達(dá)1 664.9 U/mL；吳小建等[7]從木薯廢棄物中分離得到1 株嗜熱真菌，經(jīng)鑒定為嗜熱子囊菌，固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶效果較理想；而來源于疏綿狀嗜熱真菌的木聚糖酶分泌量較低，僅為68.5 U/mL[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷更新，利用異源表達(dá)手段及分子改造技術(shù)已逐步獲得適宜工業(yè)生產(chǎn)需求的耐熱木聚糖酶。來源于GH11家族的中溫木聚糖酶XynZF-2，經(jīng)理性設(shè)計(jì)后，在其結(jié)構(gòu)中引入芳香族氨基酸殘基，突變酶最適溫度較原酶提高8 ℃且pH值穩(wěn)定性更加寬泛[9]；吳芹等[10]對(duì)來源于米曲霉的木聚糖酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，在酶分子N端引入3 對(duì)鹽橋并在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，突變酶的最適反應(yīng)溫度提升至58 ℃且溫度穩(wěn)定性得到了明顯的改善。可見，關(guān)于耐熱木聚糖酶的研究已成為木聚糖酶應(yīng)用領(lǐng)域關(guān)注的新熱點(diǎn)，而尋求高產(chǎn)、新型、熱性能優(yōu)良的木聚糖酶生產(chǎn)菌株是加快我國木聚糖酶深度工業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)。

本研究旨在從酒曲中篩選獲得高產(chǎn)耐熱木聚糖酶菌株，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行考察，以期進(jìn)一步提高木聚糖酶活力，對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行探討，為木聚糖酶的擴(kuò)大生產(chǎn)及工業(yè)應(yīng)用提供新資源及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品分別來自于山東淄博酒曲、山東淄博中酒曲庫、衡水老白干酒曲、福建紅曲、福建白藥酒曲、古大曲；櫸木木聚糖 美國Sigma公司；木糖及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

初篩培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.3%，酵母浸粉0.2%，MgSO40.05%，K2HPO40.15%，KH2PO40.6%，瓊脂2%，200 目水不溶性自提玉米芯木聚糖1%，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：土豆200 g，煮沸20 min，4 層紗布過濾，加入葡萄糖20 g，補(bǔ)足水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂，自然pH值，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.3%，硝酸鈉0.2%，KH2PO40.6%，K2HPO40.15%，MgSO40.05%，玉米芯（80 目）2%，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TCYQ型臺(tái)式恒溫振蕩器 蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；雷磁pHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)股份有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋、BSC-130IIA2型潔凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Mini-PROTEAN Tetra System小型垂直電泳 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 自提玉米芯木聚糖的制備[11]

取經(jīng)粉碎過80 目篩的玉米芯加入氫氧化鈉溶液中，固液比1∶10，煮沸后保持微沸2 h，4 層紗布過濾，棄濾渣，濾液冷卻后用濃鹽酸調(diào)pH 7.0，靜置過夜，10 000 r/min離心15 min得沉淀，用去離子水反復(fù)洗滌、離心，直至電導(dǎo)率小于100 μS/cm，將沉淀置于50 ℃條件下烘干并研磨，收集備用。

1.3.2 耐熱木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

稱取不同來源樣品0.2 g于800 μL高純水中振蕩，依次稀釋至10-2、10-3濃度梯度，取200 μL上清液均勻涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，分別標(biāo)記，于50 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。從初篩培養(yǎng)基平板中挑選有透明圈的單菌落（菌株所產(chǎn)木聚糖酶可分解培養(yǎng)基中底物木聚糖，因此菌落周圍呈現(xiàn)透明圈現(xiàn)象），劃線分離。純化后的菌株轉(zhuǎn)接至發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中（搖瓶容積250 mL，裝液量為50 mL），在50 ℃、200 r/min條件下恒溫發(fā)酵5 d，發(fā)酵液離心后取上清液在不同溫度（70、75、80 ℃）下測(cè)定木聚糖酶活力。

1.3.3 耐熱木聚糖酶產(chǎn)生菌的鑒定

將目標(biāo)菌株接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，觀察菌株形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)，并進(jìn)行顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察；真菌試劑盒提取菌株FSD0302總DNA，利用通用引物（NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’；NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’），擴(kuò)增該菌的保守核苷酸序列，擴(kuò)增程序：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；45～60 ℃、30 s；72 ℃、2 min；循環(huán)36 次；72 ℃延伸l0 min。獲得的保守序列與NCBI上檢索的同源序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終確定該菌種屬。

1.3.4 單因素發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，逐步優(yōu)化培養(yǎng)基中的玉米芯木聚糖粒度、玉米芯木聚糖質(zhì)量濃度、培養(yǎng)基初始pH值、溫度和轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件（搖瓶容積250 mL，裝液量為50 mL）。玉米芯木聚糖粒度：選擇粒度分別為8～20、20～40、40～60、60～80、80～120、120～200 目配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，添加量1%，于50 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d后測(cè)定發(fā)酵液木聚糖酶活力，確定最佳碳源粒度；玉米芯木聚糖質(zhì)量濃度：選擇玉米芯木聚糖質(zhì)量濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 g/100 mL配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于50 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d后測(cè)定發(fā)酵液木聚糖酶活力，確定最佳碳源質(zhì)量濃度；培養(yǎng)基初始pH值：在碳源粒度、碳源質(zhì)量濃度確定的基礎(chǔ)上，分別將液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，于50 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d后測(cè)定發(fā)酵液木聚糖酶活力，以確定培養(yǎng)基的最適初始pH值；溫度：在上述條件確定的基礎(chǔ)上，改變發(fā)酵發(fā)酵溫度，采用不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，200 r/min發(fā)酵5 d，測(cè)定發(fā)酵液木聚糖酶活力，確定最適發(fā)酵溫度；轉(zhuǎn)速：選擇150、175、200、225、250 r/min轉(zhuǎn)速于50 ℃培養(yǎng)5 d后測(cè)定發(fā)酵液木聚糖酶活力，確定最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及酶譜分析

SDS-PAGE分離膠為12.5%（加入2%櫸木木聚糖），濃縮膠為4.5%，考馬斯亮蘭染色顯示蛋白帶，標(biāo)準(zhǔn)蛋白與樣品在同一條件下進(jìn)行電泳。木聚糖酶樣品經(jīng)電泳后，在25%的異丙醇溶液中復(fù)性，隨后用適宜緩沖液浸泡數(shù)次以洗去異丙醇，于30 ℃反應(yīng)15 min，1%剛果紅染色20 min，1 mol/L NaCl溶液脫色至透明水解條帶出現(xiàn)。

1.3.6 木聚糖酶活力的測(cè)定

參照3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法。20 μL適當(dāng)稀釋的酶溶液，加入到180 μL用0.05 mol/L、pH 5.0的檸檬酸鈉緩沖液配制的1%櫸木木聚糖底物溶液中，60 ℃反應(yīng)10 min，用DNS法測(cè)定釋放的還原糖量，同時(shí)以木糖作標(biāo)準(zhǔn)。木聚糖酶活力單位（U）的定義為：在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmoL木糖所需要的酶量[12]。

1.3.7 蛋白含量的測(cè)定

參照Lowry等[13]的方法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.8.1 最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

采用實(shí)驗(yàn)室緩沖體系（pH 2.0～12.0）將粗酶液稀釋至合適濃度，參照1.3.6節(jié)方法測(cè)定木聚糖酶活力，確定最適反應(yīng)pH值，定義最適反應(yīng)pH值下測(cè)得的酶活力為100%；采用適當(dāng)體積上述緩沖液體系與粗酶液混合，60 ℃保溫30 min后立即冰水冷卻，測(cè)定剩余木聚糖酶活力（未經(jīng)處理的酶液為對(duì)照）。

1.3.8.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

粗酶液在50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃條件下按照1.3.6節(jié)方法測(cè)定酶活力，以確定最適反應(yīng)溫度；將粗酶液與pH 5.5的底物分別置于不同溫度（55、60、65、70 ℃）下反應(yīng)0.3、0.6、1、2、3、4 h，測(cè)定木聚糖酶活力，考察粗酶液的熱穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖像采用PowerPoint軟件處理；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件處理，發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)每組數(shù)據(jù)設(shè)置3 次平行，結(jié)果取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差；而關(guān)于酶學(xué)特性實(shí)驗(yàn)設(shè)2 次重復(fù)，每組數(shù)據(jù)設(shè)置3 次平行，結(jié)果取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐熱木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

本實(shí)驗(yàn)從眾多酒曲樣品中分離純化得到具有降解木聚糖能力的菌株40余株，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)定木聚糖酶活力，產(chǎn)酶量大于10 U/mL的菌株有10 株（表1），其中來源于山東淄博酒曲II編號(hào)為Z3-2的菌株所產(chǎn)木聚糖酶活力最高，達(dá)1 378.9 U/mL，且粗酶液最適溫度為75 ℃，初步選定該菌株為目標(biāo)菌株，且按本實(shí)驗(yàn)室菌株編號(hào)規(guī)則改寫標(biāo)號(hào)為菌株FSD0302。

表1 木聚糖酶產(chǎn)生菌初篩Table 1 Primary screening of strains for producing xylanase

2.2 菌株FSD0302的鑒定

將菌株FSD0302接種于PDA培養(yǎng)基中，50 ℃培養(yǎng)2 d后肉眼可見白色絮狀絨毛菌落，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落增大且由綠灰色漸變至黑色。顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示，菌絲蓬松細(xì)長(zhǎng)，具分隔；分生孢子垂直側(cè)生，孢子為球形單孢子，無孢子囊結(jié)構(gòu)。

圖1 菌株FSD0302顯微鏡結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Micrograph of strain FSD0302

為進(jìn)一步確定該菌種類，結(jié)合分子生物學(xué)手段，提取菌株FSD0302核糖體18S rDNA保守序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。純化擴(kuò)增產(chǎn)物后測(cè)序，在NCBI中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索挑選與目標(biāo)序列同源性高的基因序列，采用鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示，菌株FSD0302與疏綿狀絲孢菌（Thermomyces lanuginosus）ATCC 200065位于基因進(jìn)化數(shù)中的同一分支且序列同源性達(dá)70%。最終結(jié)合菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定菌株FSD0302為疏綿狀絲孢菌，并命名為T. lanuginosusFSD0302。

圖2 菌株FSD0302 18S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining analysis of partial 18S rDNA gene sequence of strain FSD0302

2.3 T. lanuginosus FSD0302發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 碳源粒度對(duì)T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)酶的影響

微生物來源木聚糖酶的產(chǎn)生需要木聚糖底物的誘導(dǎo)，因此在產(chǎn)酶條件優(yōu)化時(shí)用自提玉米芯木聚糖替換玉米芯作為發(fā)酵碳源以期獲得高產(chǎn)量酶活力。實(shí)驗(yàn)選取不同粒度的玉米芯木聚糖誘導(dǎo)T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)酶，圖3結(jié)果表明，當(dāng)玉米芯木聚糖粒度為20～40 目時(shí)，菌株所產(chǎn)酶活力最高為4 096.8 U/mL，且隨著碳源粒度的降低酶活力逐漸降低。分析原因可知，當(dāng)碳源粒度過小時(shí)，微生物可快速分解碳源用于自身生長(zhǎng)而導(dǎo)致?lián)u瓶中溶氧量的不足，影響后期產(chǎn)酶[14]；另一方面，碳源顆粒過細(xì)會(huì)與其他營養(yǎng)物質(zhì)形成的懸濁液黏度較大，影響菌株代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，使產(chǎn)酶水平降低[15]。玉米芯是我國主要的農(nóng)業(yè)廢棄物之一，以玉米芯或玉米芯來源的木聚糖作為碳源進(jìn)行生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，一方面可解決農(nóng)業(yè)廢棄物廢置污染的問題，另一方面為生物質(zhì)能源的轉(zhuǎn)化利用及農(nóng)業(yè)附加值的創(chuàng)收都具有積極意義。

圖3 玉米芯木聚糖粒度對(duì)T. lanuginosus FSD0302產(chǎn)酶的影響Fig. 3 Effect of xylan particle size on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

2.3.2 碳源質(zhì)量濃度對(duì)T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)酶的影響

圖4 玉米芯木聚糖質(zhì)量濃度對(duì)T. lanuginosus FSD0302產(chǎn)酶的影響Fig. 4 Effect of xylan concentration on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

如圖4所示，該菌產(chǎn)木聚糖酶活力隨碳源質(zhì)量濃度的增加而升高，當(dāng)碳源質(zhì)量濃度增加至4.0 g/100 mL時(shí)，木聚糖酶活力最高。而當(dāng)碳源質(zhì)量濃度過高時(shí)，菌株產(chǎn)酶量反而降低，其原因可能是過多的碳源在發(fā)酵過程中形成了較厚的懸浮物，使發(fā)酵營養(yǎng)素混合不均，影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用，另外過高的碳源質(zhì)量濃度降低了發(fā)酵環(huán)境中的溶氧量，不利于發(fā)酵產(chǎn)[16]。

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)酶的影響

圖5 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)T. lanuginosus FSD0302產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Effect of initial medium pH on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

如圖5所示，隨著pH值的升高，T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)酶活力逐漸上升，在pH 6.0時(shí)，木聚糖酶活力最高可達(dá)5 077.2 U/mL，之后隨著pH值的上升酶活力反而急劇下降。在微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝的過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及代謝產(chǎn)物的形成和積累，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值發(fā)生改變，因此發(fā)酵液初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶起著重要作用。疏綿狀絲孢菌CBS28854-M18發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶條件確定的最適pH值為7.0，高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而發(fā)酵液終止pH值變化與本研究結(jié)果類似，均處于偏堿性（pH 8.1～8.9）范圍[17]。

2.3.4 溫度對(duì)T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)酶的影響

溫度對(duì)嗜熱菌株發(fā)酵生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累起著至關(guān)重要的作用，因此考察不同發(fā)酵溫度對(duì)T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)木聚糖酶的影響。圖6表明，當(dāng)發(fā)酵溫度為50 ℃時(shí)，木聚糖酶活力最高，這一結(jié)果與同類研究疏綿狀絲孢菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的結(jié)果相同[17-18]。而當(dāng)溫度低于或高于50 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力明顯降低，即發(fā)酵溫度為45 ℃及55 ℃時(shí)菌株產(chǎn)酶活力分別為最高酶活力的83.2%和79.5%，較低的發(fā)酵溫度，延緩了菌體的生長(zhǎng)及發(fā)酵周期，不利于酶蛋白的產(chǎn)生及積累；而較高的溫度，使微生物孢子快速萌發(fā)，菌體生長(zhǎng)過快，加速菌絲體老化，酶產(chǎn)量降低。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)T. lanuginosus FSD0302產(chǎn)酶的影響Fig. 6 Effect of fermentation temperature on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

2.3.5 轉(zhuǎn)速對(duì)T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)酶的影響

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)T. lanuginosus FSD0302產(chǎn)酶的影響Fig. 7 Effects of rotational speed on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵溶氧、熱傳遞、菌絲體狀態(tài)起著重要作用。隨著轉(zhuǎn)速的增加，T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)木聚糖酶趨勢(shì)呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，在轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)木聚糖酶活力最高（圖7）。滕超等[19]研究搖床轉(zhuǎn)速對(duì)嗜熱真菌FL12產(chǎn)木聚糖酶影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到205 r/min時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力最優(yōu)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，而當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到225 r/min以上時(shí)可導(dǎo)致真菌菌絲體破碎自溶，不利于木聚糖酶的產(chǎn)生及積累。因此，適宜的轉(zhuǎn)速是菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的必要條件。

采用優(yōu)化條件，即玉米芯木聚糖粒度20～40 目、質(zhì)量濃度4 g/100 mL、培養(yǎng)基初始pH 6.0、發(fā)酵溫度50 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，對(duì)T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)木聚糖酶歷程進(jìn)行探究，結(jié)果如圖8A所示，從第2天起T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)木聚糖酶水平呈直線上升趨勢(shì)，至第6天達(dá)到產(chǎn)酶高峰，即產(chǎn)酶量高達(dá)5 357.1 U/mL，蛋白質(zhì)量濃度為0.51 mg/mL，而此時(shí)酶比活力達(dá)10 493.72 U/mg，是目前已報(bào)道疏綿狀絲孢菌液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶同類研究最高水平[20-22]。結(jié)合SDS-PAGE及酶譜（圖8B）分析可知，T. lanuginosusFSD0302產(chǎn)2 種木聚糖酶，分子質(zhì)量約為20 kDa及60 kDa，且以低分子質(zhì)量木聚糖酶為主。本研究結(jié)果與同類研究結(jié)果不同，大多數(shù)疏綿狀絲孢菌產(chǎn)單一組分木聚糖酶且分子質(zhì)量較低（20～29 kDa）[17-18,23-24]，少數(shù)研究報(bào)道有高分子質(zhì)量木聚糖酶產(chǎn)生[25]，而T. lanuginosusFSD0302可產(chǎn)兩種組分木聚糖酶，從分子質(zhì)量初步判斷分屬GH10及GH11家族[26]。因此本研究篩選獲得的T. lanuginosusFSD0302具有可深入研究的價(jià)值。

圖8 T. lanuginosus FSD0302產(chǎn)酶曲線（A）及電泳酶譜圖（B）Fig. 8 Time course of xylanase production (A) and SDS-PAGE and zymogram (B) of xylanase from T. lanuginosus FSD0302

2.4 T. lanuginosus FSD0302所產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 粗酶液最適pH值及pH值穩(wěn)定性

相關(guān)疏綿狀絲孢菌產(chǎn)木聚糖酶的研究指出，該類菌所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值在6.0～7.0居多[27-28]，而T. lanuginosusFSD0302所產(chǎn)木聚糖酶粗酶液在pH 5.5及pH 7.5時(shí)表現(xiàn)出較高的相對(duì)酶活力（圖9），此結(jié)果可能與該菌同時(shí)可產(chǎn)兩種類型木聚糖酶有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)拓寬該類菌所產(chǎn)木聚糖酶的種類及耐熱木聚糖酶的應(yīng)用有積極意義。

圖9 粗酶液最適pH值Fig. 9 Optimal pH of crude xylanase

T. lanuginosusFSD0302所產(chǎn)木聚糖酶粗酶液在pH 4.0～9.0范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，且在pH 5.0～8.0之間殘留酶活力高達(dá)80%以上（圖10）。目前報(bào)道的大多數(shù)疏綿狀絲孢菌所產(chǎn)木聚糖酶的pH值穩(wěn)定范圍在5.0～9.0之間[29-31]，其中T. lanuginosusW205所產(chǎn)單一組分木聚糖酶的pH值穩(wěn)定范圍為5.0～10.5，該酶可水解木聚糖生成以木二糖、木三糖為主的低分子質(zhì)量木聚糖且無木糖產(chǎn)生[24]。

圖10 粗酶液pH值穩(wěn)定性Fig. 10 pH stability of crude xylanase

2.4.2 粗酶液最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

圖11 粗酶液最適溫度（A）及溫度穩(wěn)定性（B）Fig. 11 Optimal temperature and thermal stability of crude xylanase

嗜熱真菌的最適反應(yīng)溫度一般在65～70 ℃之間，不同菌株之間略有差異。T. lanuginosusFSD0302木聚糖酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度為75 ℃（圖11A），這一結(jié)果優(yōu)于陳威威[23]及李文鵬[32]等的研究結(jié)果。該菌在55 ℃反應(yīng)4 h后殘余酶活力達(dá)60%以上，65 ℃反應(yīng)40 min后仍能保留50%殘余酶活力（圖11B），說明T. lanuginosusFSD0302木聚糖酶具有較好的耐熱性及熱穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

耐熱木聚糖酶可在高溫環(huán)境下發(fā)揮水解效力且表現(xiàn)出良好的溫度穩(wěn)定性而備受關(guān)注。從自然環(huán)境中篩選耐熱菌株是獲取耐熱木聚糖酶的有效途徑。目前，耐熱木聚糖酶產(chǎn)生菌以細(xì)菌和真菌居多，而真菌由于其可高效胞外分泌而成為新的研究焦點(diǎn)。本研究以富含微生物菌群的酒曲為研究樣品，篩選獲得可產(chǎn)木聚糖酶的耐熱菌40余株，經(jīng)木聚糖酶活力及酶耐熱性考察，最終確定了1 株目標(biāo)菌株FSD0302。結(jié)合微生學(xué)物形態(tài)分析及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌為疏綿狀絲孢菌。目前關(guān)于該類菌產(chǎn)耐熱木聚糖酶的研究較多，但天然菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶水平不高，本研究通過產(chǎn)酶條件優(yōu)化，T. lanuginosusFSD0302所產(chǎn)木聚糖酶活力可達(dá)5 357.1 U/mL，比活力為10 493.72 U/mg，為疏綿狀絲孢菌液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最高水平。一般而言，疏綿狀絲孢菌所分泌的木聚糖酶為單一組分，而本研究的菌株FSD0302可產(chǎn)兩種木聚糖酶分子，分子質(zhì)量分別約為20 kDa和60 kDa，粗酶酶學(xué)性質(zhì)考察結(jié)果表明該菌所產(chǎn)木聚糖酶的最適溫度為75 ℃，55 ℃反應(yīng)4 h后殘余酶活力達(dá)60%以上，65 ℃反應(yīng)40 min后仍能保留50%殘余酶活力，粗酶的最適pH值分別為5.5及7.5，且在3.5～9.0范圍內(nèi)可保留50%以上酶活力。由此可知，T. lanuginosusFSD0302所產(chǎn)木聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性且pH值耐受范圍較寬泛，具有可深入研究的價(jià)值及一定的工業(yè)應(yīng)用潛力。